ChemBioChem:蛋白质识别启动指数扩增反应(PRIEAR)及其在临床诊断中的应用

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等温指数扩增技术(EXPAR)具有灵敏度高、条件简单等优点,然而以此为基础的检测方法几乎都限于核酸分析等,如何构建基于蛋白质驱动的等温指数扩增策略仍具有一定的挑战性。


图 1 蛋白质识别启动指数扩增反应

为了充分发挥等温指数放大技术在诊断应用中的潜力,四川大学陈骏伯课题组利用识别诱导DNA组装(BINDA)原理,将蛋白质识别事件转化为核酸扩增反应的启动,设计了蛋白质识别启动指数扩增反应(PRIEAR)策略,实现了等温指数扩增技术(EXPAR)对多种蛋白类疾病标志物(PDGF-BB,thrombin,PSA,AFP)的检测。如图1所示,PRIEAR的策略主要由三部分组成:I. 包含特定DNA序列(分别为LAR的模板和引物)和亲和配体(适配子或抗体)的两条DNA探针组成的识别系统(Recognition);II. 包含相关酶的线性扩增系统(LAR);III. 包含内切酶及其识别序列的荧光报告分子(MBs)的缺口内切酶信号放大系统(NESA)和最终的荧光信号输出。


在缺乏特定蛋白质目标物的情况下,由于两条DNA探针上LAR模板和引物的互补序列很短,无法自发地组装形成双链,因此LAR不会启动。在添加蛋白质目标物后,两条DNA探针上偶联的亲和配体可以同时识别蛋白质,导致两条DNA探针非常接近,此时探针中模板和引物结构域的局部浓度显著增加,并诱导模板和引物在蛋白质上形成双链,构成稳定的闭环结构,然后在酶的帮助下,LAR反应沿着模板链发生。随后在内切酶作用下产生显著增强的荧光信号(NESA)。


图 2 以抗体为亲和配体构建的PRIEAR用于检测蛋白质的示意图;实时荧光监测稀释血清中不同浓度的(b)PSA和(d)AFP;定量检测不同浓度的(c)PSA和(e)AFP。确定临界时间t,然后将Δτ(210 min-t)用作定量信号。误差棒代表三次分析的标准偏差。

作者首先以适配体为亲和配体,分别构建了PDGF-BB和thrombin的检测平台,表现出较好的分析性能。同时,考虑到适配体的可用性仍然限制了PRIEAR的多功能性,又将其亲和配体从适配体扩展到抗体,用于检测临床肿瘤标志物PSA和AFP。如图2所示,PSA和AFP分析的荧光强度和Δτ随着反应时间的增加而增加,动态响应范围为1 pM-1 nM。且以PRIEAR进行PSA和AFP检测的LOD均低于临床诊断的阳性阈值(PSA约为121 pM,AFP约为104 pM),具有临床应用可能性。此外,作者将所构建的PRIEAR用于临床样本的检测,其结果表示可以区分健康人与患病者,展现出良好的临床应用前景。

文信息

Protein-Recognition-Initiated Exponential Amplification Reaction (PRIEAR) and Its Application in Clinical Diagnosis

Changjia Hu, Jie Zhang, Yanwen Jin, Wenjie Ma, Rongxing Zhou, Huan Du, Peng Yang, Xiandeng Hou, Nansheng Cheng, Junbo Chen 


ChemBioChem

DOI: 10.1002/cbic.202100548


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