近日，《ACS Catalysis》在线发表了来自浙江大学化学系吴起和浙江工业大学生工学院徐鉴课题组的研究论文“Rational Design of Biocatalytic Deuteration Platform of Aldehydes”（ACS Catal. 2021, 11, 13348−13354，https://doi.org/10.1021/acscatal.1c03659）。在分子动力学(MD)模拟的指导下，作者首先评估了多种ThDP依赖酶催化醛的HIE反应的可行性。在MD平衡后，作者测量了ThDP-苯甲醛形成的Breslow中间体与受体苯甲醛的羰基之间的平均距离，这可能是影响安息香缩合的关键因素。如图1所示，来自巴氏醋杆菌(ApPDC)的丙酮酸脱羧酶在结合口袋内具有高达11Å的关键距离，虽然其他因素也可能影响安息香缩合的活性，但作者假设这种较长的距离表明小的底物结合口袋只能够容纳单个苯甲醛，从而可以阻止安息香的形成，因此，这种酶显示出催化HIE反应生成氘代醛的潜力。

图1、四种典型的ThDP依赖性酶与苯甲醛的MD模拟(a-d)

作者评估了ApPDC催化苯甲醛的HIE反应效果。如表1所示，5%的DMSO中可以以中等产率(69%)和高的氘代率(D-inc.，90%)获得氘代醛产物2a，这表明酶促HIE反应是可行的。经过助溶剂筛选，5%(v/v)甲苯中可以获得更好的安息香缩合抑制效果。

接着，作者评估了该HIE反应的底物范围。在WT-ApPDC酶催化下，带有取代基的苯甲醛反应时只获得了D-inc.<5%的结果（表2）。作者认为这是由于芳环上的取代基增加了底物的体积，ApPDC的狭窄结合口袋没有足够的空间形成相应的Breslow中间体。为了将ApPDC酶的结合口袋扩大到合适的大小，以利于氘代产物的形成，但要求不够容纳两个醛分子从而抑制安息香缩合产物，作者选择了酶顶部或底部结合侧的四个大体积残基（T384、I468、E469和W388）作为突变位点。由于丙氨酸仅具有一个小体积的甲基基团，并且没有类似于甘氨酸的极其灵活的骨架几何形状，因此位点随后分别突变为丙氨酸以增加结合袋的体积。正如预期的那样，与WT相比，W388A突变体表现出显著增强的HIE，4-甲氧基和4-溴苯甲醛都获得较高的D-inc.结果。

鉴于W388A突变体的成功，作者利用这种变体拓展HIE反应的底物范围。如表3所示，几乎所有含有取代基的苯甲醛底物都能以较高产率和D-inc(>90%)获得氘代产物。但是，对于一些尺寸相对较小的醛底物，例如噻吩和呋喃等杂环醛，与W388A突变体相比，空腔比较小的WT-ApPDC更适合它们。

对于体积更大的底物，W388A的催化活性显著降低。作者认为W388A的口袋可能无法提供足够的空间来容纳大体积的底物。因此，将突变位点（T384、I468、E469）的丙氨酸突变分别引入W388A变体中，扩大结合袋以进一步增强反应性和D-inc。最终，W388A/I468A双突变体对于大体积或者多取代的芳香醛都能获得较好的氘代反应结果(表3)。有趣的是，对于一些含有醛结构的大分子药物，具有更大空腔的苯甲醛裂合酶（pfBAL）则更加适合它们的氘代醛合成反应。最后，作者还设计了两种ThDP依赖性酶催化的串联反应，利用第一步的氘代反应和第二步的安息香缩合反应，实现了手性氘代安息香的合成（表3），进一步证明了该酶催化氘代平台方法的应用广泛性。

为了更好地了解氘代活性与特定蛋白质结构之间的关系，作者分别对4-甲氧基苯甲醛与WT-ApPDC和W388A的结合进行了100 ns MD 模拟，着重考察了MD平衡后ThDP的卡宾中心与底物的羰基碳之间的距离（图2）。在WT-ApPDC 的结合口袋中，两者之间的距离超过7Å，表明大尺寸色氨酸(W388)阻止了醛底物接近ThDP，从而无法形成Breslow中间体。这种效应在突变体W388A中消失了，4-甲氧基苯甲醛很容易被W388A所接受，所分析的目标距离更短，从而能够催化氘代醛的反应。此外，4-甲氧基苯甲醛与W388A之间的结合能也比WT-ApPDC更低，从而可以更好的催化HIE反应。

该研究构建了一个生物催化醛氘代反应的平台方法，根据醛底物的结构和体积大小，理性设计具有特定空腔大小的ThDP依赖性酶催化HIE反应，从而避免生成竞争性的安息香缩合反应产物，实现各类氘代醛的高效合成。该研究为醛的氘代反应提供了一种高效、绿色的生物催化新方法，有望在有机合成、生物制药、绿色化工等领域得到应用。这一成果的通讯作者为浙江大学化学系吴起教授、浙江工业大学生工学院徐鉴研究员和嘉兴学院陈晓阳博士，该工作得到国家重点研发计划“绿色生物制造”项目和国家自然科学基金委“多层次手性物质的精准构筑”重大研究计划项目的支持。