2009年，德国莱布尼兹研究所的 Christian Hertweck 研究组于 Angew 期刊发表题为「The Biosynthetic Logic of Polyketide Diversity」的综述性文章。本文重点综述了各类 PKSs 的生物合成机制。

由于文献较长，本文将分为三部分进行解读，分别是：

• 聚酮化合物及其生物合成机制
  

• 芳香聚酮的多样性

• 复杂聚酮的多样性

上篇文章介绍了聚酮化合物及其生物合成机制和芳香聚酮的多样性（点击蓝字，进行阅读）。

本文将对复杂聚酮的多样性进行介绍。

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3 复杂聚酮的多样性

3.1 装载机制和罕见的起始单元

根据教科书中的介绍，复杂聚酮化合物主要来自乙酸酯/丙二酸酯和丙酸酯/甲基丙二酸酯，聚酮化合物的生物合成通常是将乙酰辅酶 A 装载到 PKS 上而引发的，但是实际上还有许多其他的起始单元，也有各种激活和装载策略。起始单元的选择取决于不同装载模块的底物特异性。大多数模块化 PKS 在 N 端都有一个 KS_Q 结构域，其中的活性位点半胱氨酸（VDTACSSS）已突变为谷氨酰胺（Q）残基（Scheme 25）。这些装载域将丙二酰基单元装载到 PKS 上并催化其发生脱羧反应，从而生成 ACP 硫酯。这种引发机制在模块化 PKS 中广泛存在，例如 tylosin，pikromycin 和 oleandomycin（53） PKSs。

Scheme 25

最近报道了另外一种利用乙酸盐单元引发聚酮生物合成的策略。Sherman 及其同事通过体外研究以及 X 射线晶体结构，揭示了 curacin（55）PKS 中的 GNAT 同源结构域同时具有脱羧酶和 S-乙酰基转移酶活性，该酶能够将乙酰基转移至相邻的装载-ACP（ACP_L）结构域中。这种情况似乎在 Ⅰ 型 PKS 中的 trans-AT 家族中普遍存在。

在 erythromycin 的生物合成途径中丙酰辅酶 A 的装载需要指定的 N 端装载双结构域，该结构域由装载 AT（AT_L）和 ACP 组成。其他的起始单元将会通过相同的方式以辅酶 A 硫酯的形式装载到各自的 PKS 中。例如，在 Streptomyces avermitilis 中异戊二酰基辅酶 A 通过模块型 PKS 参与 avermectin（56）的生物合成（Scheme 26）。

Scheme 26

装载模块的结构可能会有所不同，并且可能会无法判断是否会发挥作用。在参与了myxothiazol 和 soraphen（59）生物合成的 myxobacterial PKS 中有两个相邻的 AT 域，但是不清楚哪个 AT 域促进了起始单元（异戊酰辅酶 A 或苯甲酰辅酶 A）的装载和 ACP 丙二酰化。Leadlay 及其同事的通过将两个 AT 转移到 erythromycin PKS 中，证明第一个 AT 是 AT_L 并负责起始单元的装载（Scheme 27）。

Scheme 27

最后，如果起始单元被提供为游离酸，那么可以通过 NRPS-like 的腺苷酰化和硫醇化（A-ACP）装载型双结构域进行活化和装载（Scheme 28）。这种引发策略的原型是 rifamycin 和 rapamycin（61）PKSs。

Scheme 28

最近，Wenzel 等人解析了抗生素 kendomycin（65）生物合成的分子基础（Scheme 29）。该化合物由 3,5-二羟基苯甲酸酯（3,5-DHBA）起始单元组装而成，该起始单元来自 III 型 PKS 的产物 3,5-二羟基苯乙酸酯（3,5-DHPA），并被装载到模块化 I 型 PKS 的 A-ACP 双结构域中。

Scheme 29

了解起始单元的供应，活化和装载机制有助于扩大起始单元的选择范围。通过基因工程（例如交换装载结构域）或突变菌株与非天然起始单元的互补作用（突变合成），已经得到了许多新型的聚酮化合物。

3.2 其他延伸单元及构建模块

细菌中的模块化 PKS 通常利用丙二酰辅酶 A（MCoA）或甲基丙二酰辅酶 A（mMCoA）进行链延伸，从而得到未被取代的或在羰基的 α 位具有甲基支链的代谢产物。通过域诱变和域交换实验证明延伸单元类型的选择受 AT 域中特异性基序控制。也可以通过 PKS 模块中指定的甲基转移酶结构域通过 α-甲基化引入 α-甲基支链，这种现象普遍存在于细菌 I 型 PKS 中的 trans-AT 家族中，也存在于复杂的真菌 PKS 中。

在细菌聚酮化合物的生物合成中，很少观察到使用 MCoA 或 mMCoA 以外的延伸单元。一个例子是在抗生素 niddamycin 的生物合成途径中，以 2-乙基丙二酰辅酶A（eMCoA）作为延伸单元进行二碳侧链的延伸。选择 eMCoA 作为延伸单元需要由一个独立的 trans-AT 与 PKS 之间相互作用。

eMCoA 和相关的 2-烷基丙二酸酯单元是由取代的丙烯酰基-CoA 前体通过巴豆酶催化的还原/羧化反应生物合成的。以此类推，脂肪酸也可以提供一系列其他的延伸单元，实际上各种细菌代谢产物的结构暗示了 eMCoA 同源物参与了它们的生物合成，甚至可以解释 FK520 的同源物 FK506（68）中丙烯基侧链是怎么生成的（Figure 1）。

Figure 1

除了烷基化丙二酰构建模块，各种杂原子取代的丙二酰衍生物被认为参与了复杂聚酮的生物合成，如甲氧丙二酰（moM)，1,3-双（磷酸甘油酸）衍生的延伸单元等。羟基丙二酸酯（hoM）和氨基丙酸酯（aM）是 I 型 PKS 的另外两种延伸单元，hoM-ACP 的形成过程类似于 moM-ACP，而 aM-ACP 则源自丝氨酸。（Scheme 30）

Scheme 30

除了丙二酸酯和甘油酸酯延伸单元外，还可以通过使用 NRPS 生物合成逻辑将一系列其他构建模块引入到聚酮化合物中。如果 NRPS 部分位于 N 端，PKS 通常由氨基酸引发。相反，当 NRPS 位于 C 端时，聚酮化合物释放后将会与氨基酸缩合生成tetramic acid, pyridones。

3.3 复杂聚酮化合物立体化学的控制

复杂聚酮化合物因其各种构型和取代模式的排列组合而产生了大量的可能产物。尽管如此，天然产物表现出了相似的立体化学模式，该现象被称为 Celmer 法则。表明 PKSs 都有着共同的进化起源，并具有相同的酶促机制。在过去的几年中，研究人员已经对聚酮化合物立体化学控制有了深入的了解。

3.3.1 α 支链取代基的构型

在 DEBS 中，AT 域以（2S）-mMCoA 为底物，并将其装载到 ACP 域中，在缩合后，可以将 2-甲基酮酰基硫酯差向异构化为 2R 异构体（Scheme 33）。Weissman 等人的工作表明 KS 域使产物的构型发生了反转；随后的研究表明 KR、DH、ER 域均能催化异构化反应。而 AT域和 ACP 域对产物的异构化没有影响。

Scheme 33

3.3.2 酮基还原过程中的立体化学

Caffrey 通过生物信息学分析研究了 β 酮的加工规则，可以根据保守的 GVxHxA 基序上游是否存在 LDD 基序以及其他指示性残基来预测 KR 特异性。Reid 等人通过诱变和基因工程实验证明了保守的天冬氨酸残基（D）与酮还原酶的立体特异性相关，推测 KR 基序中的 D 会导致发生 D-3-羟基取代（Scheme34）。

Scheme 34

3.3.3 E 或 Z 双键的生成

在 β 酮的加工过程中，由脱水酶催化的反式消除脱水会生成反式烯烃。而 rifamycin 中顺式构型的双键相当罕见，并且原则上可以由多种机制产生。Cane 等人的研究表明，失活 pikromycin PKS 模块 2 的 DH 域会生成 D-3-羟基，反式双键消失。相反，L-3-羟基取代的硫酯被推测是 KR-DH 域产生顺式双键时的中间体。多项研究表明 D-3-羟酰基的酶促脱水反应产生反式双键，而 L-异构体则产生顺式双键（Figure 3）。

 Figure 3

3.3.4 烯基还原过程中的立体化学

截止到 2009 年，烯基还原过程中立体化学的分子基础仍不清楚。目前已鉴定了与 ER 立体化学的氨基酸序列相关的保守基序。Leadlay 及其同事通过研究各种与对映体甲基化聚酮化合物形成有关的 ER 序列，发现在产生（2S）-甲基支链的 ER 域的 NADPH 结合基序（共有序列 HAAAGGVGMA）附近存在保守的酪氨酸（Y）。相反，产生（2R）-甲基支链的 ER 结构域在该位置具有其他氨基酸，主要是缬氨酸（V）（Scheme 35）。

Scheme 35

3.4 β 支链的形成机制

如第 2 节所述，取代的丙二酰基延伸单元或 SAM 的 α-甲基化反应均会在与原 C-2 位相对应的碳原子上生成烷基支链。在几种聚酮化合物的生物合成途径中，已经观察到在对应于先前的乙酰基羧基（C-1）的位置具有一个或两个乙酸酯衍生的碳原子的烷基分支。这些取代基不是由非典型延伸单元的引入或使用亲电试剂的烷基化产生的。相反，在遗传和生化水平上的研究表明，通过使用类似于甲羟戊酸生物合成的方法引入此类β 支链。

3.4.1 异戊二烯合成逻辑

在几乎所有编码具有 β-烷基支链的聚酮化合物生物合成的基因簇中，都可以发现一组编码 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（HMG）合酶（HCS）和烯酰辅酶 A 水合酶（ECH 或巴豆酶）的基因以及独立的 KS 和 ACP 域。这些新颖的结构域首先在 pederin（80）生物合成基因簇中被发现。使用 bacillaene（81）和 curacin（82）PKS 的不同酰基 ACP 进行的体外酶促研究表明，β 取代基是在 β-酮基 ACP 与独立的乙酰 ACP 上发生由 HCS 介导的醛醇缩合反应，随后经 ECH 催化 Grob 断裂反应生成的。

多项研究表明，β-酮加工过程一般发生在链延伸中，而不是发生在链延伸之后。Piel 及其同事从一个受阻的 TE 突变体中确定了 bacillaene（81）中间体的确切质量，从而推论出 β 支链形成的确切时机。目前，trans-AT KS 特异性的生物信息学分析也可以预测 β 支链的形成。

通过对乙酸酯单元的下游加工，可以将侧链精加工成各种结构。从遗传分析看来，由 β 支链和其他处理过程产生的各种结构单元似乎是合理的。例如，β-γ-脱水和甲基化将会生成丙烯酸酯侧链 bryostatin (85)，β-甲基支链也能被羟基化和甲基化以产生甲氧基甲基 myxovirescin A (TA; 83)。

3.4.2 由迈克尔加成生成的 β 支链

抗有丝分裂剂和植物毒素 rhizoxin（88）的 β 支链是由不同的机制生成的，突变实验和途径中间体的分离表明，rhizoxin（88）的 β 支链是由支链结构域（B）介导将乙酸酯构建单元共轭添加到与酶结合的烯酰基部分生成的（Scheme 38）。

Scheme 38

3.5 链释放及主要环化

聚酮链延伸结束后将会从 PKS 中释放下来，以生成线性或环状聚酮化合物。聚酮化合物一般是由硫酯通过亲核试剂的水解或攻击而裂解释放，很少通过氧化或还原释放。水解和大环化通常被硫酯酶域催化。研究的比较详细的环化过程是 erythromycin，picromycin 和 methymycin 生物合成途径中的最终内酯化。Khosla 等人在 DEBS 的 TE 域中发现了一条底物通道，该通道贯穿整个蛋白质和一个活性位点 Asp-His-Ser 三联体，该三联体与外界水隔绝，因此比水解更有利于大环内酯的形成。

目前的研究还发现了其他的释放机制，包括：（1）不常见的 TE 域催化得到线性产物；（2）亚胺通过 Knoevenagel 缩合生成不常见骨架；（3）β-酮硫酯中间体攻击醌羰基以产生 kendomycin（65）骨架；（4）Diels– Alder 反应催化环化反应.

3.6 聚酮化合物的脂环化和杂环化

许多复杂的聚酮化合物具有中小型脂环和杂环结构，这些结构使聚酮化合物核心骨架具有刚性。环氧乙烷环通常是由细胞色素 P450 单加氧酶催化的顺式或反式双键环氧化产生的，但通过精心设计的生物合成策略可产生更大的 O 杂环或碳环亚结构。

3.6.1 O-杂环

在大环内酯类化合物中，吡喃或四氢呋喃（THF）环可自发形成，该反应是可逆的。Spirangien（92）中的螺环缩酮是由细胞色素P450单加氧酶介导的插氧反应生成的（Scheme 41）。

Scheme 41

生成中型 O 杂环的另一种策略是环氧化物的亲核开环，如聚醚化合物 monensin（93）是由聚环氧中间体经历了一个拉链型环化反应生成的。聚酮链上的羟基通过亲核进攻羰基形成半缩醛羟基，然后攻击相邻的环氧部分，在此过程中，电子沿着聚酮链传递（Scheme 42）。

Scheme 42

Nonactin（94）中的 THF 可能由另外一种策略合成。研究人员发现该化合物由一个不常见的 Ⅱ 型 PKS 合成，THF 环是由 PKS 催化羟基与丙烯酰基发生共轭加成形成的（Scheme 43）。

Scheme 43

Aureothin 类化合物中的 THF 环是由一个细胞色素 P450 单加氧酶（AurH）催化形成的，研究发现 AurH 依次催化了两个 C-O 键的形成，并决定了第一次羟基化反应的绝对构型（Scheme 44）。

Scheme 44

3.6.2 小型和中型碳环

各种复杂的聚酮化合物都能将脂环结构整合到其核心骨架中。这些脂环结构可能是由电环重排或 Diels-Alder 环加成反应产生的。其他反应如：自由基反应、共轭加成或拉链反应也会生成脂环结构。

抗肿瘤化合物 calicheamicin（97）和 C-1027（98）具有独特的双环烯二炔药效团，它们是由迭代 Ⅰ 型 PKS 合成的。研究人员发现一个环化酶能够将多烯加工成大环结构，然后一个乙酰化酶将催化去饱和反应生成炔基。生成的烯二炔插入染色体 DNA 中，并通 Bergman 环化成芳基双基导致双链断裂。值得注意的是，III 型和 II 型 PKS 也可以利用该策略生成芳香聚酮化合物。

3.7 通过模块化 PKS 中的非共线性实现多样化：迭代，跳过和多烯拼接

与迭代型 PKS（例如真菌 I 型 PKS，细菌 Ⅱ 型 PKS，以及来自植物，细菌和真菌 III 型 PKS）相反，模块型 PKS 通常与产生的代谢产物共线性。但是，越来越多研究表明存在非共线性现象，目前已经鉴定了许多跳过或迭代使用 PKS 模块的生物合成机制，个别结构域不起作用或无法催化下游或上游模块中的反应，并且在各种组装线（例如 mupirocin）中，PKS 的结构与代谢产物之间无法建立明确的关联。Trans-AT PKS 被认为是非典型 PKS 变体的最大类别。

3.7.1 “口吃”或程序化迭代

在发现模块化 PKS 可能会通过两次使用单个模块（“口吃”）产生更长的聚酮链后，又陆续发现了一些能够迭代使用的模块化 PKS（Scheme 48）。对 borrelidin（58）和 aureothin（60）生物合成途径的功能分析为细菌中模块化 I 型 PKS 的程序设计迭代使用提供了第一个直接证据。来自 aureothin 生物合成途径的 AurA 催化两次延伸和 β-酮加工过程，而来自 borrelidin 生物合成途径的 BorA5 则被迭代使用了三次。

Scheme 48

3.7.2 链释放过程中的跳过和灵活性

与迭代使用一个或多个模块相反，跳过模块会缩短聚酮化合物的链长。一个典型的例子是 pikromycin（103）PKS,它能催化聚酮链过早的释放与环化生成 12 元和 14 元环化合物（Scheme 49）。

Scheme 49

3.7.3 多烯拼接

未完待续