过氧化物酶（POD）是一类具有优异催化活性和选择性的生物催化剂，在分析传感领域的应用十分广泛。然而，天然酶较差的稳定性极大地限制了其在复杂环境中的活性和寿命，且高昂的成本阻碍了其更广泛的应用。近年来，纳米酶因其稳定性高、成本低、可批量生产而被选为天然酶的理想替代物并广泛应用于各个领域用于替代酶。然而，纳米酶的一个关键性问题在于其催化活性较天然酶仍存在不足。POD的活性位点是由五配位的亚铁血红素组成，此外，邻近的原子会直接影响Fe活性中心的电子结构，进而影响其催化活性和选择性。受到这一启发，在原子尺度下精确地设计和调控金属活性位点的结构是发展高活性纳米酶的有效策略。具体来说，纳米酶体系中结构-性能关系对于设计高性能纳米酶具有重要的指导意义，因此合理地设计调控原子级分散活性位点的电子结构和配位环境有望实现对天然酶性能的高效模拟。金属有机骨架（MOF）因其表面积大、孔隙率高、结构多样和功能可调等特点，已被广泛应用于气体吸附、存储和分离、催化及生物传感等多个领域。值得注意的是，凭借多功能有机配体和原子分散的金属结构单元，MOF的微观构型和电子结构可以通过多种策略进行有效调控。其中，有机官能团或杂原子掺入不仅可以影响临近金属原子的电子云密度、还可以改善自身的亲核性、稳定性和氧化还原电位。近年来，MOF的类酶活性引起了学术界的极大关注。然而，相较于其它类型的纳米酶，它们的催化活性仍然有待进一步提高。因此，结合有机配体的几何和电子效应对活性位点进行精准调控有望实现高活性MOF基纳米酶的合成。本文选择具有良好类POD活性的MIL-101(Fe)（简称MIL-101）作为模型，其中五配位的Fe原子作为模拟POD的活性位点。两种电负性不同的官能团（-NO2和-NH2）被引入到MIL-101（分别表示为NO2-MIL-101和NH2-MIL-101）用以调节活性位点的结构（图1）。正如预期的那样，官能团能够有效调节MIL-101的类POD活性。其活性由强到弱依次为NO2-MIL-101、MIL-101、NH2-MIL-101。实验结果表明，-NO2的引入能显著提高MIL-101对底物的亲和力，并实现其催化活性的增强。此外，理论研究表明，-NO2强的吸电子性能不仅能调节吸附态中间体的几何构型，还能优化原子级分散Fe活性位点的电子结构。得益于这些优势，NO2-MIL-101的催化反应能垒显著降低，活性得以增强。因此，协同有机配体的几何和电子效应来调节MOFs中金属位点，能够为在原子尺度下实现对活性位点的直接调控并设计高性能纳米酶提供了新的解决方案。此外，NO2-MIL-101构建的生物传感体系实现了对乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和有机磷农药（OP）的高灵敏比色检测，在生物传感领域具有广阔的应用前景。
图1. 借助有机配体官能团的几何和电子效应实现对MIL-101类POD活性的直接调控。
Ⅰ. MOFs合成及表征
图2. 纳米酶结构及形貌表征：不同MOF的（a-c）结构示意图（Fe：黄色，C：棕色，O：红色，H：粉色，N：紫色）和（d-f）TEM形貌表征。（g）NO2-MIL-101的HAADF-STEM和相应元素的EDS mapping图谱。不同MOFs的（h）XRD和（i）FT-IR图谱。
有机配体2-氨基对苯二甲酸/2-硝基对苯二甲酸被用于取代对苯二甲酸与金属离子（Fe3+）配位用以合成不同功能化的MIL-101。理论模型表明不同功能化的MIL-101的局部结构单元是相同的，除了-NH2/-NO2取代了对苯二甲酸配体中的-H（图2a-c）。TEM对MOFs表征结果证实了三种材料的形貌基本相同（图2d-f）。此外，如图2g所示，各种元素均匀地分散在NO2-MIL-101中。尤其是N元素的均匀分散说明-NO2被成功地引入到MIL-101中。XRD图谱表明所制备的MOFs具有相似的晶体结构（图2h）。红外图谱中-NH2/-NO2特征峰的显现进一步证实了官能团被成功地引入到MIL-101中（图2i）。以上的实验数据不仅验证了所构筑模型的合理性，而且为后续在同一水平下评价三种催化剂的活性提供了前提条件。
Ⅱ. 纳米酶性能评价
图3. 类POD酶活性的评价。（a）不同有机配体官能团对MOF类POD活性的调控。不同纳米酶催化TMB氧化的（b）吸收图谱，（c）比活性及（d）中间产物•OH的EPR图谱。（e）异丙醇的引入对纳米酶活性的影响。（f）纳米酶催化H2O2的Km。
基于金属活性位点(Fe)含量相同的条件下，利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色反应评价纳米酶的类POD活性（图3a）。研究发现，-NO2的引入增强了MIL-101的类POD活性，而-NH2却减弱了其催化活性（图3b）。通过测定纳米酶的比活性（SA）实现对其催化效率定量评价（图3c），NO2-MIL-101和MIL-101的SA分别是NH2-MIL-101 的7.91倍和2.77倍。随后的电子顺磁共振（EPR）光谱验证了羟基自由基（•OH）的存在（图3d），并且它们的信号峰强度与相应地类POD活性具有良好地一致性。加入•OH的清除剂异丙醇到反应体系后，纳米酶的催化活性显著降低，表明•OH是主要的活性中间体（图3e）。此外，纳米酶的稳态动力学评价结果表明NO2-MIL-101对H2O2催化具有较小的米氏常数（Km），这证明了其对H2O2的亲和力较高（图3f）。而NH2-MIL-101则表现出相反的结果。
Ⅲ. 理论计算
图4. 纳米酶催化反应的理论计算。（a）NO2-MIL-101在酸性环境下反应的基本步骤示意图。（b）纳米酶催化反应的能量变化图。（c）吸附在纳米酶上H2O2*的几何结构（从左至右分别为MIL-101、NH2-MIL-101、NO2-MIL-101）。（d）Fe 3d轨道上PDOS及费米能级的分布。（插图：Fe活性位点附近的局部视图）。（e）HO*-Fe键及其对应的pCOHP示意图（排列顺序与（c）图相同）。
根据图4a中给出的反应途径详细地计算每个步骤的反应能量。H2O2的分解作为速率决定步骤（RDS）决定了整个反应的催化活性（图4b）。RDS的能量变化是NO2-MIL-101(1.28 eV) < MIL-101(1.55 eV) < NH2-MIL-101(1.65 eV)，这与纳米酶的催化活性结果是一致的。为了探究NO2-MIL-101催化活性优越的原因，我们首先研究了-NO2对吸附态H2O2*的几何效应。有趣的是，在NO2-MIL-101上，吸附态H2O2*的O-H键的取向偏向于-NO2上的氧（图4c）。相比之下，MIL-101和NH2-MIL-101没有观察到显著地变化。-NO2强的电子吸收作用使得H··O-N-O距离缩短，这种变化有利于O-O键的断裂，从而减少OH*形成能的变化。为了从电子结构的角度进一步揭示-NO2的影响，计算了-NO2对NO2-MIL-101电荷密度的影响。从图4d可以看出，NO2-MIL-101在dxz方向上的投影电子状态密度分布（PDOS）增大，而在dz2方向上的PODS显著减小，而在NH2-MIL-101上则没有明显变化。因此，我们认为NO2-MIL-101活性的增强可能是Fe活性位点上的悬空键(dz2)方向上的电子减少所致。为了深入了解催化反应中改变的3d轨道分裂的作用，通过计算投影晶体轨道汉密尔顿粒子数（pCOHP）及费米能级揭示活性位点吸附的HO*和Fe原子之间的相互作用（图4e）。NO2-MIL-101中HO*-Fe键（费米能级以下蓝色区域）的反键轨道填充量小于MIL-101和NH2-MIL-101，说明反键轨道中的电子减少了。反键轨道电子的减少可以使得HO*-Fe的键长增加，促进H2O2*的裂解并有效减少RDS的能量变化。
Ⅳ. 生物传感器的构建
图5. 生物传感器的构建。（a）AChE 活性检测示意图。（b）不同体系催化TMB的吸收光谱。不同浓度AChE 活性检测的吸收光谱（c）以及线性检测范围（d）。（e）生物传感器的选择性评价。
AChE作为人体内一种关键性的酶在神经系统中发挥着重要的作用，因而精确地评价AChE的活性对于疾病的诊疗具有重大意义。基于AChE催化硫代乙酰胆碱生成含巯基的硫代胆碱，该产物会显著影响NO2-MIL-101对TMB催化的显色反应（图5a）。因此，本文利用双酶串联反应（AChE-POD）实现了对AChE活性的高灵敏度及高选择性检测（图5b-e）。线性检测范围是0.2-50 mU mL-1，检测限为0.14 mU mL-1。此外，有机磷农药（OP）会造成AChE失活，影响机体的正常活动。因此，该生物传感器被进一步用于OP有效地检测。
综上所述，通过在有机配体中引入强的吸电子（或给电子）官能团（-NO2或-NH2）能够实现对MIL-101中原子级分散的金属位点的直接调控。实验证明，-NO2官能化显著改善了纳米酶对底物的亲和性，并实现了其类POD活性的极大提高。然而-NH2官能化则表现出与之相反的结果。此外，理论计算表明，邻近的-NO2不仅可以改变吸附态（H2O2*）的几何构型，促进O-O键的断裂，还可以优化原子分散Fe的电子结构，有利于中间产物（OH*）的吸附。得益于这些独特的优势，NO2-MIL-101的催化反应能垒显著降低，活性得以增强。基于此，我们成功地利用NO2-MIL-101构建了高灵敏比色检测AChE活性和OP的生物传感器。同时该传感器表现出良好的选择性、重复性和稳定性，在实际样品分析中具有潜在的应用前景。这项工作不仅为有机配体的结合几何和电子效应开发高性能纳米酶提供了有效的策略，而且拓展了纳米酶在生物传感中的应用。
原文:
Weiqing Xu et al. Tuning atomically dispersed Fe sites in metal-organic frameworks boosts peroxidase-like activity for sensitive biosensing
Nano-Micro Lett. 12, 184 (2020).
原文链接：
https://link.springer.com/article/10.1007/s40820-020-00520-3
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