摘  要：目的  探讨氯化两面针碱对人食管癌Eca109细胞的抑制作用及其诱导凋亡的分子机制。方法  采用CCK-8法检测不同浓度的氯化两面针碱不同的干预时间对Eca109细胞的增殖抑制率。依据CCK-8法的结果将实验设4组，各组氯化两面针碱的终浓度分别为0、5、10、15 μmol/L，药物作用时间为48 h。以AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测凋亡率；以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测Caspase-3、Caspase-9和Noxa的mRNA表达；采用Western blotting法检测cleaved Caspase-3、Bcl-2、p53和Noxa的蛋白表达水平。结果  氯化两面针碱对Eca109细胞具有增殖抑制作用，一定范围内呈时间和浓度依赖性。流式细胞术结果显示，5 μmol/L的氯化两面针碱主要诱发早期凋亡（P＜0.01）；10、15 μmol/L的氯化两面针碱主要诱发的是晚期凋亡（P＜0.01）。qRT-PCR结果显示，Caspase-3、Caspase-9和Noxa的mRNA表达均随氯化两面针碱的浓度增加而升高，其中10、15 μmol/L组升高比较显著。Western blotting法结果显示，cleaved Caspase-3、p53和Noxa的蛋白水平均随氯化两面针碱浓度的增加而升高（P＜0.01），但Noxa的升高在5 μmol/L组不显著，在10、15 μmol/L组升高明显（P＜0.01）；Bcl-2蛋白的表达随着氯化两面针碱浓度的升高而降低，10、15 μmol/L组较为显著（P＜0.05、0.01）。

食管癌是一种较为常见的消化系统上皮组织恶性肿瘤，发病率在恶性肿瘤中居第5位，病死率居第3位。我国食管癌发病率和死亡率均较高，每年约20万人死于食管癌。由于食管癌初发时症状较为隐匿，一旦发现常常是中晚期。目前最主要的治疗方法是手术，但食管癌术后5年生存率较低，约为38%^[1]。临床常用化疗药物逐步产生耐药，因此急需开发毒副作用相对较小且疗效较好的药物。近年来发现两面针在抗肿瘤方面有较大的潜力，氯化两面针碱是两面针的主要成分之一，且目前尚未有氯化两面针碱抗食管癌的研究报道。因此本实验以人食管癌Eca109细胞为实验对象，观察氯化两面针碱对其活力的影响，探讨可能的作用靶点和分子机制，为氯化两面针碱应用于临床抗食管癌提供理论依据。

1 材料

1.1 细胞

Eca109细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药品与试剂

氯化两面针碱（质量分数97%，批号18062121）购自上海同田生物技术公司；RPMI 1640培养基、青霉素/链霉素双抗购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂购自日本Takara公司；β-actin抗体、GAPDH抗体、Bcl-2抗体、p53抗体、Noxa抗体购自英国Abcam公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.3  仪器

Scientific Varioskanflash多功能酶标仪（Thermo公司）；实时荧光定量PCR仪（Roche公司）；Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR公司）；FC500流式细胞仪（Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 CCK-8法检测细胞活性

Eca109细胞，使用含10%胎牛血清、青霉素（1×10⁵ U/L）和链霉素（100 mg/L）的RPMI 1640完全培养基，在5% CO₂、37 ℃、饱和湿度条件下培养，细胞融合度约为90%时以0.25%胰酶消化传代。取处于对数生长期Eca109细胞，以单细胞悬液每孔1×10⁴个接种于96孔板上。分组设置：空白组为不含细胞的RPMI 1640培养基（10%胎牛血清），对照组为不含氯化两面针碱的正常培养细胞，实验组的氯化两面针碱终浓度分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μmol/L，每组设置6个复孔。分3个时间梯度：12、24、48 h。按CCK-8说明书进行检测，测定吸光度（A）值。并按照公式计算增殖抑制率。

增殖抑制率＝(A_对照－A_实验)/(A_对照－A_空白)

2.2 Annexin V-FITC/PI双染法测细胞凋亡

将对数生长期Eca109细胞，以单细胞悬液按每孔5×10⁵个接种于6孔板。根据增殖抑制率的结果，将实验组最终设置为3组，药物终浓度分别为5、10、15 μmol/L，药物作用时间为48 h。正常培养的细胞作为对照组。药物作用结束后用不含EDTA的胰酶消化并离心收集细胞。以磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，去除胰酶，再次离心后每组以100 μL的1×binding buffer重悬细胞。加入Annexin V-FITC 5 μL/管，吹打混匀，室温避光孵育15 min，而后加入PI 5 μL/管，立即上机检测。

2.3  实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测凋亡相关基因的表达

细胞培养、分组以及干预方案同“2.2”项。用胰酶消化并收集细胞；离心柱法提取总RNA。将mRNA逆转录合成cDNA按说明书进行。qRT-PCR反应体系为20μL，反应条件：95 ℃预变性5min；40个循环：95℃、10 s，55 ℃、30 s；72 ℃ 10min。熔解曲线起始温度为60 ℃，每30秒升高0.5 ℃，至95 ℃结束。实验组的目的基因相对于对照组的表达量以双∆法计算得出。所用引物见表1。

2.4  Western blotting法检测凋亡相关蛋白的表达

细胞培养、分组以及干预方案同“2.2”项。用胰酶消化，离心收集细胞，预冷的PBS清洗细胞，再次离心后加入裂解液在冰上裂解提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度后，100 ℃水浴加热10min，使所提取蛋白充分变性，−20 ℃存放。根据BCA法所测蛋白结果于SDS-PAGE凝胶中加入充分变性的蛋白样本。经过电泳以及湿法电转后室温封闭1 h，而后在相应的一抗中4 ℃孵育过夜。后经TBST洗涤，加入相应二抗室温孵育2 h后在红外激光成像系统中扫描显影。后期经过Image J软件分析相应条带的灰度值。并计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，以消除上样量差异。以该比值计算出目的蛋白的相对表达量。

2.5 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对实验结果进行分析，数据以表示，先进行正态检验以及方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 对Eca109细胞活性的影响

CCK-8法检测氯化两面针碱作用后细胞的增殖抑制率。结果显示，氯化两面针碱对Eca109细胞具有明显的增殖抑制作用，随着作用时间的延长，各实验组细胞的增殖率明显降低；同时随着药物浓度的增加，细胞的增殖率也显著下降。因此氯化两面针碱对Eca109细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性，结果见图1。

3.2 对Eca109细胞凋亡率的影响

流式细胞术检测结果见表2和图2，各实验组的总凋亡率与对照组相比差异均非常显著（P＜0.01）；5 μmol/L的氯化两面针碱主要引起Eca109细胞的早期凋亡（P＜0.01）；10、15 μmol/L的氯化两面针碱主要引起Eca109细胞的晚期凋亡（P＜0.01），且10 μmol/L氯化两面针碱组细胞早期凋亡率与对照组相比差异也非常显著（P＜0.01）。

3.3  对Eca109细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响

结果见图3。与对照组相比，经氯化两面针碱干预后的Eca109细胞中凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和Noxa的mRNA均有一定程度的上调，除了5 μmol/L氯化两面针碱组外，与对照组比较，差异均显著（P＜0.05、0.01）。

3.4  对Eca109细胞凋亡相关蛋白表达的影响

由图4可见，与对照组相比，各实验组的p53、cleaved Caspase-3以及Noxa蛋白表达均有一定程度上调，其中p53和cleaved Caspase-3呈现比较明显的浓度依赖性且差异比较显著（P＜0.01）；Noxa在10、15 μmol/L氯化两面针碱组的表达升高比较明显（P＜0.01）；Bcl-2表达在10、15 μmol/L氯化两面针碱组随着氯化两面针碱浓度的增加而降低（P＜0.05、0.01）。

4 讨论

近年来有研究表明，两面针对多种肿瘤有抑制作用^[2-7]。本研究的结果显示不同浓度的氯化两面针碱对Eca109细胞均有增殖抑制作用，并且抑制作用随着浓度的增加和干预时间的延长而更加明显。Annexin V-FITC/PI双染法检测Eca109细胞凋亡率结果显示5 μmol/L氯化两面针碱组主要发生早期凋亡，10、15 μmol/L氯化两面针碱组主要发生晚期凋亡。

多细胞生物的细胞增殖和死亡平衡使机体处于稳态。而细胞死亡的形式有多种，包括坏死、凋亡、自噬等等。凋亡是生理条件下机体维持稳态的重要机制。肿瘤细胞的无限增殖与凋亡异常密切相关。目前认为凋亡的主要途径为死亡受体途径和线粒体途径，其他还有MAPK通路、内质网通路、p53通路、NF-κB通路等。其中线粒体途径诱导的凋亡与p53通路关系紧密，错综复杂。

据文献报道，氯化两面针碱抑制结直肠癌细胞、胃癌SGC7901细胞和人骨肉瘤MG-63细胞的增殖过程中均有Caspase-3和Caspase-9mRNA的表达升高^[5-9]，因此推测氯化两面针碱抑制Eca109细胞的增殖也有Caspase-3和Caspase-9的参与。本研究的qRT-PCR的结果显示10、15 μmol/L的氯化两面针碱使Eca109细胞Caspase-3、Caspase-9和Noxa的mRNA表达明显高于对照组。Caspase-9在线粒体途径诱导的凋亡中位于Caspase级联反应的顶端，由细胞色素C激活^[10]。Noxa属于Bcl-2家族中BH3亚家族成员，在凋亡的发生和发展的过程中起着重要的促进作用。凋亡信号刺激后，p53可直接结合Noxa上游的靶位点，促进Noxa的表达^[11-12]。Noxa常通过2种方式起作用：一是通过BH3结构域与线粒体膜上的抑凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL的BH1、BH2结合，使后者对Bax、Bak的抑制作用丧失；二是直接与Bax、Bak相互作用，使其转换构象，促进线粒体途径的凋亡发生^[13-16]。因此氯化两面针碱所诱导的Eca109细胞凋亡或许与线粒体有着密切的关系，故进一步以Western blotting法检测了Noxa、Bcl-2和p53的表达，以及cleaved Caspase-3的水平。结果显示，除了Bcl-2的表达是随着氯化两面针碱浓度的增加而降低之外，其余均显著升高。

多种诱导凋亡的药物都可以激活p53。它在凋亡中起着非常重要的作用，其结构包括4个功能区：DNA结合区、转录激活区、低聚反应区和基础区。p53通过转录激活区调节靶基因的表达，通过低聚反应区和基础区调节与靶蛋白的结合，产生各种生物学效应^[17]。在诱发凋亡的过程中，p53与Bcl-2/Bax或者Bcl-xL/Bax等复合体相互作用，使促进凋亡的Bax等解离出来进而形成寡聚体使线粒体膜通透性增大，释放促凋亡蛋白，导致胞浆中的凋亡效应分子活化，引发凋亡^[16,18]。例如释放出来的细胞色素C可以使胞浆中的Caspase-9活化而诱发线粒体凋亡途径。

综上所述，氯化两面针碱对Eca109细胞有明显的抑制作用，并且主要是通过凋亡实现的。这为食管癌的治疗带来了新的希望。本研究表明氯化两面针碱诱导Eca109细胞的凋亡与p53和Noxa的表达升高和Bcl-2的下调以及Caspase-3的活化有关。本研究为将来氯化两面针碱在食管癌方面的治疗提供了初步依据，但更详细的调控作用有待进一步阐明。