分享一篇最近发表在JACS上的文章，题目为Cyclic Hydroxylamines for Native Residue-Forming Peptide Ligations: Synthesis of Ubiquitin and Tirzepatide。文章的通讯作者是来自苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的Jeffrey W. Bode教授。

    多肽片段的化学选择性连接是蛋白质化学合成中的强大策略，现有方法包括天然化学连接（native chemical ligation，NCL）、丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）连接等。而为实现无半胱氨酸（Cys）或易聚集序列的连接，作者先前开发了α-酮酸-羟胺（KAHA）连接策略。然而，这一策略会引入高丝氨酸（homoserine）这一非天然氨基酸残基，因此不适用于只含天然氨基酸残基的序列片段连接，如泛素或多肽活性药物成分（API）等。为此，如图1所示，作者改进了KAHA策略，利用环状羟胺作为KAHA的反应模块，在温和条件下实现了亮氨酸-异亮氨酸（Leu-Ile）和赖氨酸-异亮氨酸（Lys-Ile）的连接。

图1. 四种多肽连接策略。

    如图2所示，作者从先前Gouverneur和Ghosez报道的工作中受到启发，设计合成了含光敏感保护基的N-环状羟胺异亮氨酸-苯丙氨酸（Ile-Phe）二肽。反应路线共7步，最终能够以17%的总产率得到KAHA反应前体7。

图2. N-环状羟胺取代的Ile-Phe二肽合成路线。

    如图3所示，作者在泛素的合成中应用了这一策略。他们将泛素分为两个片段（1-43、44-76），两片段连接处为Leu43-Ile44。研究表明，在固相多肽合成的条件下，单体7能够顺利与片段46-76的N端反应，且环状羟胺也不会被脱除。随后，N上光敏保护基在365 nm波长光的照射下被脱除，得到N-端带有环状羟胺反应模块的片段9a。另一片段1-43中，Leu42被改造为缩酮保护的Leu α-酮酸，随后在弱酸条件下缩酮保护基被脱除，得到C端带有α-酮酸反应模块的片段8a。最后，两个片段在室温和乙酸条件下，以48%的产率高效连接。高效液相色谱（HPLC）和高分辨质谱（HRMS）表征结果均证明了泛素的成功合成。

图3. KAHA策略应用于泛素合成。

    如图4所示，作者还将KAHA策略应用于替尔泊肽（TZP）的合成。他们将替尔泊肽分为两个片段（1-16、17-39），连接处为Lys16-Ile17。首先，他们采用类似的固相多肽合成方法，合成了片段前体12和13。两片段能够在乙酸催化下实现Lys和Ile的连接，以42%的产率得到TZP产物。HPLC和HRMS表征结果均证明了TZP的成功合成。

图4. KAHA策略应用于TZP合成。

    总结来说，作者在先前KAHA策略的基础上，采用环状羟胺作为反应模块，进一步优化了KAHA的反应条件，并拓宽了该策略的适用性。该策略适用于连接处含Leu的片段，可以作为NCL和Ser/Thr连接的补充。然而，将环状羟胺引入N端、α-酮酸引入C端在合成上存在不小的难度，这极大地限制了该策略的应用。尽管如此，这一策略还可以应用于疏水性或热敏感多肽等传统连接策略无法实现的合成，为天然多肽和蛋白的化学合成提供了额外的有效策略和合成思路。

作者：CHR  审校：QJC

DOI: 10.1021/jacs.5c11881

Link: https://doi.org/10.1021/jacs.5c11881