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给大家介绍一篇发表在Nature Chemical Biology上的文章，标题是“Immobilized enzyme cascade for targeted glycosylation”，通讯作者是英国帝国理工学院的Karen M. Polizzi教授和Cleo Kontoravdi教授，Karen教授的主要研究方向是体内生物传感器和合成生物学，Cleo教授的主要研究方向是将系统工程原理应用于生物过程，尤其是代谢和糖基化修饰。在本文中，作者提出了一种快速制备固定化酶并用于级联反应制备均一聚糖结构的方法。
糖基化是影响蛋白质折叠、半衰期和功能的关键翻译后修饰。由于所涉及酶的混杂性，糖基化是一个非模板化的非均一过程。本文描述了一个用于定制糖结构(SUGAR-TARGET)的顺序糖基化反应的平台，该平台允许通过一步固定/纯化方法产生的固定化酶在体外实现定制的、可控的N-糖基化。作者重建了一个反应级联，模拟糖基化途径，其中天然存在混杂性，以使来自不同细胞系统的一系列蛋白质人源化，产生近乎均一的糖型。利用固定化β-1,4-半乳糖转移酶提高了三种IgG的半乳糖基化谱，半乳糖基化率为80.2 ~ 96.3%。酶回收的反应时间大于80小时。该平台易于实现，模块化和可重复使用，因此可以产生来自各种宿主的均质聚糖结构，用于功能和临床评估。 N-聚糖结构往往是异质的，这阻碍了对单个结构的研究，并限制了我们对其生物学作用的理解。至关重要的是，定义和控制所需的聚糖组成是蛋白类药物的质量控制的一部分，以此确保安全性和有效性。利用糖基化的有益特性和合成具有明确糖型的蛋白质的愿望促进了糖工程领域的发展。常用的糖工程做法包括遗传修饰宿主细胞的糖基化通路，如CHO细胞，植物和昆虫细胞，通过敲除/过表达天然酶或突变体来实现。目前人源糖型修饰或对某种糖型进行过表达均已实现。在微生物菌株如毕赤酵母中进行人源糖基化生产，或者在大肠杆菌中进行设计新的糖基化通路也是可行的。但基于基因工程方法进行定制功能的聚糖生产是耗时的，这需要设计复杂的基因调控网络，并对能产生所需糖型的克隆进行筛选。修改天然糖基化途径会干扰细胞功能，包括生长，这会导致成本增加和生产规模限制。此外，缺乏对通路操作的严格控制以及酶和糖供体的可及性仍然导致糖谱不均一，进而发生一些非目的糖型导致的脱靶效应和免疫原性。 体外糖工程允许严格的反应条件控制，化学酶法将预组装的聚糖整体转移到适当的修饰蛋白上。但该方法会产生一些化学副产物，同时操作过程也并不简单。体外酶处理是一种简单的替代方法，但其中的局限性包括由于酶活竞争而缺乏均一性，不希望的酶交叉反应性以及需要纯化蛋白，导致材料和酶的损失。为了固定化糖基转移酶，本文开发了一种体内生物素化的方法，这允许后续只经过一步固定/纯化。SUGAR-TARGET解决了酶混杂性问题，允许定制、均一的生产N-糖基化蛋白，不需要化学修饰即能合成一系列不同的目标糖型。
Fig.1 靶向糖基化的人工高尔基体反应(SUGAR-TARGET)策略与设计
Fig.2 GnTl和GalT体内生物素化及一步固定化/纯化实验流程
作者首先测试SUGAR-TARGET合成均一游离聚糖的能力，后者能用于表征酶-底物互作或糖结合蛋白如lectin，但想要合成得到高纯度的产物比较困难。为了高效的得到均一游离聚糖，作者在每一步酶反应后进行离心，以分离产物和酶，并使用MALDI-TOF MS监测反应，发现GnTI能将M5以大于95%转化率转化GM5，ManII能将GM5以大于95%转化率转化为GM3，GalT也能将GM3以大于95%转化率转化为GalGM3（图1）。在SUGAR-TARGET体系下每种酶的特异性均接近100%。
Fig.3 固定化酶对mFc的催化级联
紧接着，作者对来自各种糖工程宿主的不同治疗兴趣的糖基化蛋白的适用性进行探索，目的是证明SUGAR-TARGET可以用于修饰一系列细胞来源的物质。作者选用经过糖工程改造的毕赤酵母菌株SuperMan5表达mFc片段，以及HEK293细胞系的GnTI敲除株表达saposin B，以上两种株系均能产生主要为M5的糖结构。通过分泌表达，Ni-NTA纯化得到纯度约97%的mFc，并将蛋白固定在磁珠上进一步缩短了分离时间（图3）。在GnTI-ManII-GalT-SiaT的催化级联中，每步反应均使用MS进行监测。结果显示4步级联反应中每一步转化率均大于95%且糖型均一，证明了SUGAR-TARGET能解决酶的竞争反应并减少糖的非均一性。此外，作者尝试使用SUGAR-TARGET生产saposin B，最终以大于95%的转化率得到了S1GalGM3糖型的saposin B。
Fig.4 使用GalT对IgG进行处理
进一步的，作者分别在3种来源的IgG中验证Gal修饰的影响，即CHO细胞生产的人源糖型IgG（CHO h-IgG），兔血清来源的IgG（r-IgG）和人血清来源的IgG（h-IgG），并用毛细管电泳验证了糖型分布（图4）。3种IgG均在固定化GalT处理后显示出末端Gal高表达，Gal修饰率均提高到大于80%。
Fig.5 固定化GalT处理聚糖
由于GalT修饰涉及多次Gal的修饰过程，作者想将固定化GalT用于研究GalT对底物G0和G0F的特异性，发现由于游离聚糖反应速率较快，必须缩短反应时间到15min左右才有可能捕获中间产物。通过毛细管电泳监测发现，α-1,3臂的单个Gal修饰是限速步，因此认为在进行IgG修饰时，Gal首先在α-1,6臂发生修饰，随后在α-1,3臂发生修饰。由于Gal修饰对糖蛋白类药物有重要意义，因此作者尝试探究固定化GalT的可复用性，具体来说将GalT用于4次独立的反应循环中，中间只经过回收和洗涤。实验发现固定化GalT经过80 h使用后仍能保留70%活性，首次使用时可将末端Gal修饰率从52%提高到97.4%，第四次使用时仍能将末端Gal修饰率提高到84%，因此认为SUGAR-TARGET可以用于生产糖蛋白产品。
总的来说，作者开发了SUGAR-TARGET平台进行糖酶的一步快速纯化/固定，并证明通过级联反应的形式能以高收率得到均一聚糖或糖蛋白。 本文作者：MY 原文引用： https://doi.org/10.1038/s41589-023-01539-4
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