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发表在JACS上的研究进展,题为:Site-Selective Deuteration of Amino Acids through Dual-Protein Catalysis。在该工作中,作者使用转氨酶DsaD搭配小蛋白DsaE成功实现了氨基酸Cα和Cβ位的氘代。该工作的通讯作者是来自威斯康星麦迪逊大学的Andrew R. Buller。
长期以来,氘代化合物因独特的物理和化学性质吸引着科研人员。例如,将药物小分子关键位置的氢用氘取代可以改变其药代动力学,以延长作用时间。目前,已经有数种已知药物的氘代物进入了临床试验,或已批准上市(图1)。此外,将化合物氘代是研究分子间相互作用和化学反应机理的重要手段。在蛋白质生物化学中,将氨基酸氘代是研究酶反应机理、追踪代谢途径和改善NMR信号的重要方法。正因如此,发展氨基酸的位点选择性氘代方法非常重要。
图1. 小分子药物的氘代
目前,一些方法从氘代底物出发从头合成Cα和Cβ位氘代氨基酸,或者是预先活化氨基酸的氨基,再通过碱性条件下的H/D交换来得到Cα氘代氨基酸。然而,这些方法在步骤上都十分繁琐,因此急需发展直接以氨基酸作为底物的选择性Cα和Cβ氘代方法。
在寻找可能方法的过程中,作者认为酶促反应是非常具有潜力的氘代途径。一方面,酶活性位点的三维结构限制了底物的反应构象,保证了高度的位点和立体选择性。另一方面,经过生物体亿万年的进化,大量的酶直接以氨基酸作为底物,因此无须额外的保护基和导向基等修饰。此前,有工作基于含磷酸吡哆醛(PLP)的酶,通过可逆形成烯胺中间体,成功实现了氨基酸的Cα和Cβ氘代,但底物范围较为有限(图2)。
图2. 含磷酸吡哆醛的酶催化的氘代
在寻找合适的酶催化体系过程中,作者从L-allo-Ile(L-别异亮氨酸)的生物合成中得到了启发。异亮氨酸,即(2S, 3S)-Ile,是20种常见氨基酸之一,而L-别异亮氨酸,即(2S, 3R)-Ile,是存在于细菌中的天然产物。Streptomyces scopuliridis中有两个催化L-别异亮氨酸生成的酶:(1) DsaD,一种基于PLP的转氨酶和(2) DsaE,一个小的伴侣蛋白(图3)。异构化过程需要两个蛋白同时参与,缺一不可。在机理上,PLP与氨基酸的氨基首先结合,生成亚胺,进而α位去质子,得到中间体13(图4)。再次去质子得到非手性的烯胺中间体10(图3),该中间体在酶催化下重新质子化,实现β位的异构化。最后,α位质子化,脱除PLP,得到L-别异亮氨酸产物。该机理的提出并不困难,但研究人员对该过程中两个蛋白各自的作用仍不明确。本篇文章中,作者一方面在重水中进行该酶促反应,以研究其详细机理,另一方面通过该反应实现了氨基酸的选择性氘代(图4)。
图3. L-别异亮氨酸的生物合成
图4. 本工作的原理设计
首先,作者详细分析了DsaD/E双蛋白催化体系的动力学,研究了两个蛋白的化学计量比对反应速率的影响。动力学实验最终支持如图5所示的反应机理。异亮氨酸(Ile)和DsaD可逆结合生成亚胺中间体18,若不存在DsaE下,该中间体发生可逆的去质子和结合质子,最终给出α位氘代产物;而当DsaE存在时,DsaE和DsaD通过弱相互作用结合(KM = 40 μM),使得后者的活性中心三维结构发生改变,与Ile的结合更为紧密,并大大降低了β位异构化的能垒。最终,DsaD/E体系使得Ile发生α位氘代,以及β位异构化和氘代,给出产物23。
图5. 双蛋白氘代体系的机理
随后,作者研究了DsaD/E体系是否可以催化其他氨基酸的位点选择性氘代。值得庆幸的是,该体系对其他一些氨基酸也有较好的α和β位氘代效果(图6)。然而,对于一些侧基含有极性基团的氨基酸,氘代转化率较低。作者认为这是酶更倾向于和非极性氨基酸结合导致的。将极性基团用烷基修饰,例如将酪氨酸的酚氧甲基化,可以提高酶和底物的结合能力,从而大大提高氘代率。
图6. 反应条件和底物范围
最后,作者探究了该体系作为制备级氨基酸位点选择性氘代平台的可行性(图7)。如果仅用DsaD在重水处理氨基酸底物,便可得到α位氘代产物;而先用DsaD/E在重水中处理,再在水中用DsaD处理,便可以得到β位氘代产物。
图7. 制备级氨基酸氘代
综上,作者巧妙利用异亮氨酸差向异构DsaD/E催化体系实现了位点选择性的氨基酸氘代,多种脂肪族和芳香族氨基酸都可以通过此方法较高转化率地得到α或β位氘代产物。
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