发表在JACS上的研究进展，题为：Site-Selective Deuteration of Amino Acids through Dual-Protein Catalysis。在该工作中，作者使用转氨酶DsaD搭配小蛋白DsaE成功实现了氨基酸Cα和Cβ位的氘代。该工作的通讯作者是来自威斯康星麦迪逊大学的Andrew R. Buller。

长期以来，氘代化合物因独特的物理和化学性质吸引着科研人员。例如，将药物小分子关键位置的氢用氘取代可以改变其药代动力学，以延长作用时间。目前，已经有数种已知药物的氘代物进入了临床试验，或已批准上市（图1）。此外，将化合物氘代是研究分子间相互作用和化学反应机理的重要手段。在蛋白质生物化学中，将氨基酸氘代是研究酶反应机理、追踪代谢途径和改善NMR信号的重要方法。正因如此，发展氨基酸的位点选择性氘代方法非常重要。

图1. 小分子药物的氘代

目前，一些方法从氘代底物出发从头合成Cα和Cβ位氘代氨基酸，或者是预先活化氨基酸的氨基，再通过碱性条件下的H/D交换来得到Cα氘代氨基酸。然而，这些方法在步骤上都十分繁琐，因此急需发展直接以氨基酸作为底物的选择性Cα和Cβ氘代方法。

在寻找可能方法的过程中，作者认为酶促反应是非常具有潜力的氘代途径。一方面，酶活性位点的三维结构限制了底物的反应构象，保证了高度的位点和立体选择性。另一方面，经过生物体亿万年的进化，大量的酶直接以氨基酸作为底物，因此无须额外的保护基和导向基等修饰。此前，有工作基于含磷酸吡哆醛（PLP）的酶，通过可逆形成烯胺中间体，成功实现了氨基酸的Cα和Cβ氘代，但底物范围较为有限（图2）。

图2. 含磷酸吡哆醛的酶催化的氘代

在寻找合适的酶催化体系过程中，作者从_L-allo-Ile（L-别异亮氨酸）的生物合成中得到了启发。异亮氨酸，即(2S, 3S)-Ile，是20种常见氨基酸之一，而_L-别异亮氨酸，即(2S, 3R)-Ile，是存在于细菌中的天然产物。Streptomyces scopuliridis中有两个催化L-别异亮氨酸生成的酶：(1) DsaD，一种基于PLP的转氨酶和(2) DsaE，一个小的伴侣蛋白（图3）。异构化过程需要两个蛋白同时参与，缺一不可。在机理上，PLP与氨基酸的氨基首先结合，生成亚胺，进而α位去质子，得到中间体13（图4）。再次去质子得到非手性的烯胺中间体10（图3），该中间体在酶催化下重新质子化，实现β位的异构化。最后，α位质子化，脱除PLP，得到L-别异亮氨酸产物。该机理的提出并不困难，但研究人员对该过程中两个蛋白各自的作用仍不明确。本篇文章中，作者一方面在重水中进行该酶促反应，以研究其详细机理，另一方面通过该反应实现了氨基酸的选择性氘代（图4）。

图3. L-别异亮氨酸的生物合成

图4. 本工作的原理设计

首先，作者详细分析了DsaD/E双蛋白催化体系的动力学，研究了两个蛋白的化学计量比对反应速率的影响。动力学实验最终支持如图5所示的反应机理。异亮氨酸（Ile）和DsaD可逆结合生成亚胺中间体18，若不存在DsaE下，该中间体发生可逆的去质子和结合质子，最终给出α位氘代产物；而当DsaE存在时，DsaE和DsaD通过弱相互作用结合（K_M = 40 μM），使得后者的活性中心三维结构发生改变，与Ile的结合更为紧密，并大大降低了β位异构化的能垒。最终，DsaD/E体系使得Ile发生α位氘代，以及β位异构化和氘代，给出产物23。

图5. 双蛋白氘代体系的机理

 随后，作者研究了DsaD/E体系是否可以催化其他氨基酸的位点选择性氘代。值得庆幸的是，该体系对其他一些氨基酸也有较好的α和β位氘代效果（图6）。然而，对于一些侧基含有极性基团的氨基酸，氘代转化率较低。作者认为这是酶更倾向于和非极性氨基酸结合导致的。将极性基团用烷基修饰，例如将酪氨酸的酚氧甲基化，可以提高酶和底物的结合能力，从而大大提高氘代率。

图6. 反应条件和底物范围

最后，作者探究了该体系作为制备级氨基酸位点选择性氘代平台的可行性（图7）。如果仅用DsaD在重水处理氨基酸底物，便可得到α位氘代产物；而先用DsaD/E在重水中处理，再在水中用DsaD处理，便可以得到β位氘代产物。

图7. 制备级氨基酸氘代

综上，作者巧妙利用异亮氨酸差向异构DsaD/E催化体系实现了位点选择性的氨基酸氘代，多种脂肪族和芳香族氨基酸都可以通过此方法较高转化率地得到α或β位氘代产物。