ACS Cent. Sci.|LSECtin识别固定的二分支N-聚糖的特定表位

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推荐一篇发表在ACS Cent. Sci.上的文章,文章标题是Immobilization of Biantennary N-Glycans Leads to Branch Specific Epitope Recognition by LSECtin。其通讯作者是巴斯克研究与技术联盟的Jesús Jiménez-Barbero。课题组从化学的角度探索分子识别事件,特别是在溶液中受体识别聚糖的分子基础。在本文中,作者用NMR对LSECtin识别不对称N-聚糖进行了研究。


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LSECtin是Ca2+依赖性聚糖结合受体C型凝集素家族的成员,在肝脏、淋巴结、骨髓和血窦内皮细胞中表达。全长受体的一般结构由胞外结构域(ECD)、跨膜疏水结构域和胞内N端尾组成。ECD可进一步分为为颈部区域和碳水化合物识别域(CRD)。颈部区域的77和 159位存在两个N-糖基化位点,这两个位点对于LSECtin在细胞表面的有效表达至关重要。

在聚糖微阵列中,LSECtin倾向于结合α1-6分支上的GlcNAcβ1-2Man基序,而非α1-3分支上的异构体。而且,在α1-6分支上带有 β1-4 GalNAc/Gal延伸的复杂型N-聚糖被LSECtin识别,而在α1-3分支上相同的修饰则完全不能与LSECtin结合。这种选择性说明聚糖结构的细微差异会导致结合事件的显着变化。因此,作者通过NMR检测了LSECtin与不对称N-聚糖的识别过程。

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图1. 本研究中使用的LSECtin的模型和配体




作者首先通过NMR研究了最小结合表位——GlcNAcβ1-2Man 二糖和LSECtin之间的相互作用。已有的报道表明,两者的结合亲和力为3.5μM。通过将配体添加到含有凝集素的样品中,进行了基于1H NMR的滴定实验,使蛋白质与配体的比例分别为1:0、1:1、1:2、1:5、1:10和1:20。在比例达到1:2之前,出现了NMR信号的变化,之后达到饱和,这与报道中低微摩尔亲和力的相互作用一致。

作者随后研究了LSECtin与图1中所示的复合型N-聚糖之间的相互作用。已有的报道表明,G0对LSECtin的结合亲和力为2.6μM。作者进行了与GlcNAcβ1-2Man同样的NMR实验,结果显示,G0表现出与上述二糖相似的趋势,表明两种分子与LSECtin的结合亲和力非常接近。在LDN3和LDN6中也进行了同样的实验,结果显示,两者具有相同的模式,表明溶液中两者与凝集素的相互作用类似,这与固定在聚糖微阵列上时对相同的N-聚糖进行观察的结果明显不同。

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图2. GlcNAcβ1-2Man、G0、LDN3和LDN6滴定LSECtin的1H NMR光谱




接着,作者对LSECtin和复合型N-聚糖形成的复合物进行了STD NMR实验。对于G0来说,大多数STD-NMR信号对应于两个末端 GlcNAc残基,其上的所有质子都是NMR等效的,因此无法区分。同时,其STD结果与GlcNAcβ1-2Man二糖一致,表明LSECtin通过该结构与N-聚糖相互作用。

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图3. LSECtin和G0形成的复合物的STD NMR




而对于不对称聚糖,LDN3中6-Man残基的STD NMR信号很明显,未见3-Man残基的STD NMR信号。同样地,在LDN6中观察到了3-Man残基的 STD NMR信号,而6-Man残基的STD NMR信号却没有观察到。在GlcNAc残基也观察到了类似的现象,对于LND3,观察到了α1-6分支末端GlcNAc的STD NMR信号,而对于LDN6,α1-3分支末端的GlcNAc信号也出现在STD NMR光谱中。

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图4. LSECtin和不对称N-聚糖形成的复合物的STD NMR




GlcNAc和GalNAc上N-乙酰基的STD NMR也侧面印证了结合模式。对于G0,两个GlcNAc的乙酰基的STD NMR信号都可以观察到。对于LDN3,仅出现α1-6分支的乙酰基信号,而对于LND6,仅观察到α1-3分支的乙酰基信号。

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图5. GlcNAc残基上乙酰基的STD NMR




基于以上结果,作者认为末端的GalNAc起到了停止信号的作用,即阻止在该位点的结合,并提出了如图6所示的模型。

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图6. LSECtin识别的N-聚糖结合表位




最后,基于以上结果,作者假设当聚糖附着在表面时,LDN3中 α1-6分支上的GlcNAcβ1-2Man表位受到阻碍,在溶液中则不会有这一问题。因此,作者通过分子模拟对LSECtin的识别进行了概念验证。在模型中,PEG8作为接头,固定在纤维素板上。从分子动力学模拟分析结果可以看出,α1,3连接的分支暴露在溶剂中,因此可以与受体结合,而α1,6连接的GlcNAcβ1-Man表位被部分掩埋在极性表面中,这可能使其与LSECtin结合的能力下降。

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图7. LDN3和LDN6的分子动力学模拟




综上所述,作者在溶液中进行的NMR研究证实了GlcNAcβ1-2Man部分是LSECtin识别的最小表位。在溶液中,不对称的LDN3和LDN6都被LSECtin识别;而在聚糖阵列上,该凝集素仅识别LDN6。本文得到的结果在分子识别领域具有重要意义,分子识别会因所研究分子所处的状态不同而产生很大差异。以聚糖为例,阵列上的聚糖显然更接近于真实细胞表面的情况,其所得出的结论也更适合于从体外环境类推到体内环境。




文章作者:CXY

DOI:10.1021/acscentsci.2c00719

责任编辑:LD




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