Nat. Chem. | 利用光激活四嗪实现活细胞的选择性生物正交化学

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分享一篇发表在Nature Chemistry上的文章,文章标题为“Light-activated tetrazines enable precision live-cell bioorthogonal chemistry”。其通讯作者是来自University of California, San Diego的Neal K. Devaraj教授。其课题组主要研究人造细胞与生物膜的合成,RNA检测与标记工具的开发,四嗪相关的生物正交反应。


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生物正交反应在研究生命系统的过程中起着相当重要的作用。在提出的众多生物正交反应中,四嗪与亲双烯体之间的的快速逆电子需求Diels-Alder反应已在化学生物学和材料科学中得到广泛应用。例如,四嗪连接已被用于动物蛋白质组标记,循环肿瘤细胞的捕获、跟踪脂质修饰和糖基化的成像等。此外,亲双烯体可以保护多种官能团,这些官能团在与四嗪的环加成反应后释放出来,这种“点击释放”的策略已被用于肿瘤成像、控制酶活性和药物输送等。但是,在生命体系的研究过程中,时间与空间的可控性至关重要,最近,通过对亲双烯体进行设计,科研人员实现了紫外光诱导的四嗪连接。然而,紫外线对活细胞有毒,特别是哺乳动物细胞,这限制了此反应的应用。作者设想使用光激活光保护的四嗪来实现四嗪的时空可控性,促进生物系统中的精确化学标记。

为了开发具有高时空精度的光触发四嗪连接,作者首先探索了四嗪前体二氢四嗪是否可以被光激活基团保护。二氢四嗪对亲二烯体无反应性,其可在空气中氧化形成四嗪。光脱笼基团保护可以防止二氢四嗪氧化成四嗪,产生一种对TCO无反应活性的化合物。保护基团在光照条件下脱除,随后氧化形成四嗪。原位形成的四嗪能够通过逆电子需求Diels-Alder环加成与亲二烯体迅速反应。通过直接激活四嗪,可以实现空间控制。


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图1 活细胞中的光控生物正交四嗪连接


接下来,作者合成了光裂解基团保护的二氢四嗪。作者首先合成了四嗪,随后利用还原剂将其还原为二氢四嗪,然后将光裂解基团对二氢四嗪进行保护(图1b)。在分析了光裂解基团保护的二氢四嗪1a的吸光度光谱后,作者选择了405nm的LED光用于保护基团的脱除(图1c)。HPLC显示,当在37°C的接触空气的水相缓冲液中用LED光(405nm,18 W)照射2分钟时,94%的1a(16μM)被脱保护,形成的四嗪2a有74%的收率。这些结果与其他的光活化生物偶联反应(如四唑光点击化学)形成的反应物的产量相当。作者还研究了其他波长激活的光保护基团以及二氢四嗪上不同取代基对脱除效率与反应收率的影响,如表1所示,此方法适用于多种光保护基团与取代基,并有进一步扩大底物的空间。

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表1 光保护的二氢四嗪



在合成了光激活的二氢四嗪之后,作者探索了特定的生物偶联应用。考虑到普通四嗪的碱不稳定性,作者研究了光保护二氢四嗪在碱性条件的稳定情况。在4-甲基哌啶/ DMF溶液中,40%的四嗪2a在30分钟内降解,而保护的二氢四嗪1a在4-甲基哌啶/ DMF溶液中稳定,在相同的反应条件下没有观察到降解的出现。因此,作者推测光保护二氢四嗪可以耐受SPPS。为了测试这一点,作者合成了含有保护二氢四嗪的非天然Fmoc保护氨基酸,并利用SPPS获得了五肽1j(图2 a)。在PBS中在37°C下将光保护的二氢四嗪肽1j(10μM)照射2分钟后,形成的四嗪肽2f的转化率为96%(图2b)。能够直接使用光保护的四嗪氨基酸有助于对含有多个生物正交手柄(如叠氮基和四嗪)的肽进行SPPS,从而更容易用多个探针特异性标记肽链。

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图2 具有光活化基团的二氢四嗪肽链的早期功能化


由于此策略利用LED光直接从其前体生成四嗪,因此作者研究了其是否可以用于活细胞的时空可控修饰。为了将二氢四嗪修饰到细胞膜上,作者合成了含有可光激活二氢四嗪的DPPE衍生物1k(图3b)。在将1k与HeLa细胞共孵育后,为了触发四嗪的原位形成和随后的生物正交四嗪连接,作者使用蔡司880激光扫描显微镜用405nm激光(20 mW)选择性地照射细胞群中的单个细胞20秒。激光照射五分钟后,荧光活细胞成像以揭示在激光照射细胞的膜上是否发生了四嗪连接。AF488的荧光标记仅在激光照射细胞的膜上观察到,在相邻细胞上则没有观察到,这表明可以使用1k实现四嗪连接的精确时空光活化(图3c)。为了证明光活化单细胞操作的多功能性,我们还使用替代TCO-AF568(图3d)进行了标记。最后,为了测试空间光活化的普适性,作者在0.75 mm×0.75 mm区域内,对位于四个不同位置的一个或两个细胞的群体在405nm处选择性地进行激光照射以触发四嗪连接,从而改变相关的细胞膜(图3e)。仅在激光照射的细胞上观察到荧光标记,表明可以通过表面四嗪的光活化来实现活细胞的可靠时空标记。


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图3 通过四嗪连接光活化对HeLa S3细胞膜进行单细胞标记


最后,作者将光激活四嗪与点击释放策略相结合,在生命系统下控制治疗药物的释放。为了将可光激活的四嗪连接与点击释放偶联,作者合成了一种亲二烯体修饰的前体药物,TCO-Dox 3c,在与四嗪进行环加成反应后释放阿霉素5a(Dox)(图4a)。阿霉素是一种抗癌药物,因此作者试图利用光来刺激阿霉素通过双重激活过程递送到癌细胞(图4a),从而引发细胞凋亡。为了提高该方法的生物相容性,作者探索了使用香豆素保护的二氢四嗪1c,以使用450nm的LED光在活的Hep 3B癌细胞存在下实现化疗药物多柔比星的释放(图4)。如图4b所示,当使用1c(8μM)和TCO-Dox 3c(5.5μM)的混合物处理Hep 3B人肝癌细胞时,未观察到细胞活力降低。然而,在用LED光(450nm,18 W)照射2分钟,然后孵育24小时时,观察到细胞活力降低57±2%。细胞活力的损失与在相同条件下用Dox 5a(5.5μM)直接处理细胞时观察到的相似。当细胞在1a(8μM),TCO-Dox 3c(5.5μM)或单独存在副产物4c(5.5μM)的情况下用LED光照射2分钟时,对细胞活力没有影响。这些结果表明,光激活基团保护的二氢四嗪可用于在活细胞存在下光触发释放生物活性化合物,如化疗药物。


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图4 光激活的四嗪前体药物治疗Hep 3B癌细胞


总之,作者展示了一种利用保护的二氢四嗪的光活化形成四嗪的方法。保护二氢四嗪在碱性条件下是稳定的,因此能够将生物正交手柄在早期掺入生物分子(如肽)中。其允许使用无细胞毒性的LED光来触发活哺乳动物细胞上的四嗪连接。通过用荧光团标记磷脂,作者还证明了该策略可以实现单细胞空间分辨率的HeLa细胞膜的修饰。最后,作者表明,通过将四嗪光活化与响应于四嗪连接释放前体药物的策略相结合,光激活的治疗策略是可行的。


文章作者:HYD

DOI:10.1038/s41557-022-00963-8

责任编辑:LD




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