分享一篇发表在Nature Chemistry上的文章，文章标题为“Light-activated tetrazines enable precision live-cell bioorthogonal chemistry”。其通讯作者是来自University of California, San Diego的Neal K. Devaraj教授。其课题组主要研究人造细胞与生物膜的合成，RNA检测与标记工具的开发，四嗪相关的生物正交反应。

生物正交反应在研究生命系统的过程中起着相当重要的作用。在提出的众多生物正交反应中，四嗪与亲双烯体之间的的快速逆电子需求Diels-Alder反应已在化学生物学和材料科学中得到广泛应用。例如，四嗪连接已被用于动物蛋白质组标记，循环肿瘤细胞的捕获、跟踪脂质修饰和糖基化的成像等。此外，亲双烯体可以保护多种官能团，这些官能团在与四嗪的环加成反应后释放出来，这种“点击释放”的策略已被用于肿瘤成像、控制酶活性和药物输送等。但是，在生命体系的研究过程中，时间与空间的可控性至关重要，最近，通过对亲双烯体进行设计，科研人员实现了紫外光诱导的四嗪连接。然而，紫外线对活细胞有毒，特别是哺乳动物细胞，这限制了此反应的应用。作者设想使用光激活光保护的四嗪来实现四嗪的时空可控性，促进生物系统中的精确化学标记。

为了开发具有高时空精度的光触发四嗪连接，作者首先探索了四嗪前体二氢四嗪是否可以被光激活基团保护。二氢四嗪对亲二烯体无反应性，其可在空气中氧化形成四嗪。光脱笼基团保护可以防止二氢四嗪氧化成四嗪，产生一种对TCO无反应活性的化合物。保护基团在光照条件下脱除，随后氧化形成四嗪。原位形成的四嗪能够通过逆电子需求Diels-Alder环加成与亲二烯体迅速反应。通过直接激活四嗪，可以实现空间控制。

表1 光保护的二氢四嗪

图2 具有光活化基团的二氢四嗪肽链的早期功能化

由于此策略利用LED光直接从其前体生成四嗪，因此作者研究了其是否可以用于活细胞的时空可控修饰。为了将二氢四嗪修饰到细胞膜上，作者合成了含有可光激活二氢四嗪的DPPE衍生物1k（图3b）。在将1k与HeLa细胞共孵育后，为了触发四嗪的原位形成和随后的生物正交四嗪连接，作者使用蔡司880激光扫描显微镜用405nm激光（20 mW）选择性地照射细胞群中的单个细胞20秒。激光照射五分钟后，荧光活细胞成像以揭示在激光照射细胞的膜上是否发生了四嗪连接。AF488的荧光标记仅在激光照射细胞的膜上观察到，在相邻细胞上则没有观察到，这表明可以使用1k实现四嗪连接的精确时空光活化（图3c）。为了证明光活化单细胞操作的多功能性，我们还使用替代TCO-AF568（图3d）进行了标记。最后，为了测试空间光活化的普适性，作者在0.75 mm×0.75 mm区域内，对位于四个不同位置的一个或两个细胞的群体在405nm处选择性地进行激光照射以触发四嗪连接，从而改变相关的细胞膜（图3e）。仅在激光照射的细胞上观察到荧光标记，表明可以通过表面四嗪的光活化来实现活细胞的可靠时空标记。

图3 通过四嗪连接光活化对HeLa S3细胞膜进行单细胞标记

最后，作者将光激活四嗪与点击释放策略相结合，在生命系统下控制治疗药物的释放。为了将可光激活的四嗪连接与点击释放偶联，作者合成了一种亲二烯体修饰的前体药物，TCO-Dox 3c，在与四嗪进行环加成反应后释放阿霉素5a（Dox）（图4a）。阿霉素是一种抗癌药物，因此作者试图利用光来刺激阿霉素通过双重激活过程递送到癌细胞（图4a），从而引发细胞凋亡。为了提高该方法的生物相容性，作者探索了使用香豆素保护的二氢四嗪1c，以使用450nm的LED光在活的Hep 3B癌细胞存在下实现化疗药物多柔比星的释放（图4）。如图4b所示，当使用1c（8μM）和TCO-Dox 3c（5.5μM）的混合物处理Hep 3B人肝癌细胞时，未观察到细胞活力降低。然而，在用LED光（450nm，18 W）照射2分钟，然后孵育24小时时，观察到细胞活力降低57±2%。细胞活力的损失与在相同条件下用Dox 5a（5.5μM）直接处理细胞时观察到的相似。当细胞在1a（8μM），TCO-Dox 3c（5.5μM）或单独存在副产物4c（5.5μM）的情况下用LED光照射2分钟时，对细胞活力没有影响。这些结果表明，光激活基团保护的二氢四嗪可用于在活细胞存在下光触发释放生物活性化合物，如化疗药物。