摘要：测试了超临界二氧化碳（SC-CO2）对脂溶性维生素（A，D，E和β-胡萝卜素）的提取，取代了传统的液体提取方法，这些传统方法需要大量的有机溶剂。超临界流体萃取（SFE）是一种用于脂溶性维生素的快速萃取技术，只需使用少量有机溶剂即可精确的提取。对超高温灭菌乳，奶粉，猪肝酱（婴儿配方奶粉），婴儿配方奶粉和罐装婴儿食品进行提取，以比较这些方法。得出的较好的方法是基于使用SC-CO2和甲醇作为改性剂来提取脂溶性维生素及其酯。使用光度检测的高效液相色谱法分析用于维生素分析。结果显示提取方法之间没有显著差异。所提出的超临界流体萃取方法似乎可用作传统有机溶剂方法的替代品，主要用于维生素A和γ-生育酚。

关键词：分析SFE，脂溶性维生素，高效液相色谱法，婴幼儿产品，肉制品，乳制品，超临界二氧化碳

牛奶和肉类产品等食品行业一直在寻求更快，更有效的分析方法来确定其原料和最终产品的维生素含量。传统的维生素分析方法通常适用于单独的维生素测定，有时需要大量的试剂，时间和样品。维生素A和E测定通常基于比色法，在测定前在氧化铝柱上纯化提取物；β-胡萝卜素通过分光光度法测定，维生素D测定通过HPLC进行。对于常见的食物，含有0.3 mg/100 g维生素A的样品，使用这些方法需要40g样品，维生素E测定需要10 g样品；对于干燥的食品需要40 g，超高浓度温牛奶（UHT-牛奶）需要60 mL；UHT牛奶中维生素D3的测定需要200 mL样品。因此，传统方法需要使用大量的有机溶剂进行萃取和皂化，从而导致成本增加和环境安全风险增高。此外，用于比色测定时，提取物的纯化需要增加分析时间，这导致维生素降解。光和氧还会降解维生素A和E.

已开发出分析型超临界流体萃取（SFE）以取代使用有机溶剂的传统分析方法。SFE是一种快速提取技术，可以使用少量有机溶剂完全提取和测定不溶性维生素。分析方法使用的样品量范围为0.5-2.0g。提取后，将样品皂化并再次提取，使得可以通过HPLC直接分析提取物。

在该研究中，通过比较SFE和常规方法进行脂溶性维生素提取这两种技术。在UHT-牛奶，奶粉，猪肉，肝酱（婴儿配方奶粉），婴儿配方奶粉和罐装婴儿食品中测定α-生育酚和维生素A. 维生素D3，仅在UHT-牛奶和婴儿配方中测定；并且在婴儿配方奶粉和罐装婴儿食品中测定了γ-生育酚和日 β- 胡萝卜素。这项研究是在国际项目下进行的，旨在将分析方法SFE与从食品中提取脂溶性维生素的传统方法进行比较。获得的结果说明了所提出方法的优势。

实验步骤

设备：使用具有1cm石英比色皿的双光束分光光度计，其能够测量190-800nm范围内的吸光度，用于测定其纯度。超临界流体实验室提取器，FA-100TM，提取压力高达700bar，温度高达423K，能够进行静态和动态提取，并在本研究中使用。另一种超临界流体实验室提取器，Speed SFETM，其提取压力高达700 bar，温度高达523 K，也用于本研究。在适当的溶剂中，在室温和大气压下完成提取物收集。两个装置都没有系统泵来添加溶剂，并且没有自动添加收集溶剂；因此，在两个单元的萃取过程中手动添加溶剂，并在需要时手动重新填充收集溶剂。

高效液相色谱法系统由Varian2010泵和Rheodyne 7025进样器组成，并配有UV-visVarian Varichrom检测器。检测器使用0.2吸光度单位满量程的灵敏度。使用Varian DS 654 整合量化峰。

材料： UHT低乳糖（1.5％脂肪），奶粉（脂肪含量不可用），猪肉（14％脂肪），肝酱（23％）脂肪），婴儿配方奶粉（奶粉混合物; 2.5％脂肪）和罐装婴儿食品（2.8％脂肪）均为市场级，参加欧盟-公正项目。脂肪含量是在所有产品的可接受范围内。产品是在提取分析之前储存在277K。L（+）-抗坏血酸-二酸（分析纯），二氯甲烷（色谱纯），二异丙醚（分析纯），正己烷（色谱纯），异丙醇（色谱纯），甲基（色谱纯），石油醚（313-333 K）（p.a。）和氢氧化钾（分析纯）均购自Carlo Erba公司（意大利）。全反式视黄醇（≥99％），α-生育酚（≥98％），γ-生育酚（≥97％）（维生素E），胆钙化醇（≥99％），麦角钙化醇（99％），醋酸视黄醇（95％全反式异构体，5％顺式异构体），β-胡萝卜素和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（99％）全部从Fluka公司（瑞士）购买。乙腈（色谱纯）和乙醇（99.9％）均购自J.T.贝克（意大利）。购买乙酸铵（分析纯）来自Rudi Pont S.（意大利）。亲水性惰性载体基质（LECO-Dry）购自LECO公司。6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸（分析纯）购自默克公司（德国）。三乙胺（99％）是来自Sigma-Aldrich公司（意大利）。二氧化碳（99.998％）和氮（≥99.9995％）得自Linde-Caracciolossigeno公司（意大利）。

标准解决方案：制备了两种标准溶液。标准溶液A由全反式视黄醇5mg溶于10mL乙醇中，nL-α-生育酚（10mg溶于10mL甲醇），γ-生育酚（10mg溶于10mL甲醇中），维生素D3（10mg溶于10mL乙醇中），维生素D2（10mg，10mL乙醇），视黄醇乙酸酯（10mg溶于10mL乙醇中）和β-胡萝卜素（3mg溶于10mL）正己烷）。标准溶液B.（从溶液A获得，用于校准标准品的连续稀释）由全反式视黄醇（在10mL乙醇中加入1mL溶液A.），nL-α-生育酚（在50mL乙醇中的5mL溶液A.），γ-生育酚（50mL乙醇中加入5mL溶液A），维生素D3（50 mL乙醇加入500uL溶液A），维生素D2（50 mL乙醇中加入500uL溶液A），视黄醇乙酸酯（10mL乙醇中加入500ul溶液A），β-胡萝卜素（50mL正己烷中加入5mL溶液A）。

通过在参比池中用适当的溶剂测量1cm石英比色皿中溶液的吸光度来进行标准溶液的纯度测试。然后使用相应的摩尔消光系数以计算浓度。将所有标准物质和溶液储存在255K冷藏的琥珀色小瓶中，并在分析前检查所有标准品的纯度。

通过将20g氢氧化钾溶解在20mL纯净水中制备50％氢氧化钾溶液

样品制备：（i）混合物A：DHT-牛奶，奶粉，肉和肝酱。0.5士0.05g样品（2士0.05g用于测定全反视黄醇和α-生育酚，而10士0.05g用于测定UHT牛奶中的维生素D3）与1士0.05g惰性载体基质和0.5士0.05g抗坏血酸在研钵中。

（ii）混合物B：婴儿配方奶粉。 将0.5士0.05g样品与0.5士0.05g水在研钵中用玻璃棒混合，直至看不到样品块。将湿样品与1.0士0.05g惰性载体基质和0.5士0.05g抗坏血酸在研钵中混合。

（iii）混合物C：婴儿，食物。 在研钵中将1.0士0.05g样品与1.0士0.05g惰性载体基质和0.5士0.05g抗坏血酸混合。

将样品混合物（A，B，C）放入底部含有0.4士0.05g惰性载体基质的套管中，轻轻按压固定。然后加入干燥惰性基质直至填充萃取容器，并且当需要添加助溶剂时和在需要时提取纯SC-CO2后，将1.5mL甲醇加入萃取器容器的顶部。

SFE条件： 维生素A，D3，α-生育酚和γ-生育酚提取使用单一提取工艺进行UHT-牛奶，奶粉，肉和肝酱。提取持续15分钟（静态）加60分钟（动态） 在进行萃取时使用1.082g / min的液态CO2流速。加入甲醇作为共溶剂，质量比为5％（摩尔分数= 0.066）。萃取压力和温度分别为366bar和353K（萃取溶剂密度为0.823g / mL）。限流器温度保持在358K。收集溶剂是15mL含有约5-10mg棕榈酰抗坏血酸的异丙醚/乙醇（50:50 vol eight o1）。

使用纯SC-CO2（第一次提取）进行双重提取以提取上述维生素维生素，以及通过添加甲醇作为共溶剂（第二次提取）来完成婴儿配方食品和罐装婴儿食品的日胡萝卜素提取。第一次提取用纯净的SC-CO2进行，静态提取时间为5分钟，动态提取时间为40分钟，压力为380bar，提取温度为313K（CO2密度为0.954克/毫升），限流器 温度为318K，二氯甲烷/正己烷（50：50体积/体积）含有5-10mg BHT作为收集溶剂。通过加入甲醇作为改性剂进行第二次萃取; 萃取压力和温度分别为380bar和353K（萃取溶剂密度为0.830g / mL;摩尔分数= 0.066）。 温度限制为358K，收集溶剂为15mL含有5-10mg棕榈酰抗坏血酸的异丙醚/乙醇（50：50体积/体积）。

上述LECO FA-100提取器用于测定维生素A，E和β-胡萝卜素浓度。为了获得所需的CO2 /甲醇比，在萃取过程中每10分钟手动加入2mL甲醇，每次减压。为了达到总提取时间，进行了四次连续10分钟的动态提取。使用提取器仅从UHT-牛奶和婴儿配方食品中提取维生素D3，并使用50ml容器和10g样品来增加维生素浓度。使用LECO FA-100时手动添加甲醇。

皂化：将SFE提取物在氮气下浓缩，然后通过向提取物中加入4mL乙醇，10-20mg抗坏血酸和1mL50％KOH溶液进行皂化。当在UHT-牛奶中测定维生素D3时，加入100uL维生素D2（约10ug / mL）作为内标以校正皂化过程中的损失。将含有提取物的样品管在氮气下轻轻冲洗，然后在水浴（313K）中保持30分钟。然后在皂化过程中每10分钟剧烈摇动样品。

当皂化完成时，将样品在自来水下冷却（在整个过程中排除光）。 然后将6mL 纯净水和5mL石油醚加入收集管中，剧烈摇动至少1分钟。平衡后，将管在自来水下冷却以分离各相，倾析出4.5mL有机相并用Mi11iQ水洗涤两次。然后除去4mL有机相，在氮气下蒸发至干。然后加入乙醇（500μL）作为溶剂，过滤所得溶液，然后直接注入HPLC系统。 当维生素浓度接近检测限时，加入50uL乙酸视黄醇溶液（约25ug/mL）作为内标，而仅加入200mL乙醇（而不是500μL）作为溶剂，改善检测。

高效液相色谱：通过比较各个峰的保留时间与使用标准溶液获得的色谱图来鉴定维生素。使用用标准建立的浓度曲线，用两个数学公式（参见下面的等方1和2）计算维生素浓度。

所有高效液相色谱测定至少一式两份进行；对于UHT-牛奶和奶粉样品，进行了四次测定。

高效液相色谱条件如下：流速1.0mL/min；温度291-296K;注射量20uL；色谱柱奥泰C18色谱柱（意大利），膜厚5um，250 x 4.6 mm（视黄醇，维生素D3，γ-生育酚和α-生育酚）和VYDAC 201TP54 C18色谱柱，250×4.6毫米（对于（3-胡萝卜素）。高效液相色谱流动相为甲醇/水（96：4），用于维生素A，维生素D3，γ-生育酚和α-生育酚测定，以及乙腈/ 用于日胡萝卜素测定的0.05M乙酸铵的甲醇/二氯甲烷（75：20：5），含有50mg BHT/L和0.5mL /L三乙胺。上述分析物的检测波长为325nm，维生素A， 维生素D2和D3为265nm，γ-生育酚为295nm，β-胡萝卜素为450nm。

计算。 对于全反视黄醇，γ-生育酚和α-生育酚和β-胡萝卜素：

其中C=计算的维生素浓度（mg/100g）； Cste =标准溶液的浓度（mg/mL）； As =样品的维生素峰面积；Astd =标准溶液的维生素峰面积；m=样品的重量（g）； V1= HPLC分析前的样品提取物的最终体积（mL）； V2=加入到皂化提取物（mL）中的提取溶剂的体积；和V3=用氮气（mL）蒸发的洗涤有机相的体积。

对于维生素D3：

其中C=计算的维生素浓度（mg/100 g）； Ce =提取物中维生素的浓度（mg/mL）； V1 =最终样品体积（V = 0.250mL）； m =样品的重量（g）；和Q =维生素的校正系数，表示为

其中Ds =样品中内标（维生素D2）的面积；和Di =内标混合物中内标（维生素D2）的面积。

常规方法：使用液体提取方法在EUFAIR项目下进行分析。用比色法测定UHT-牛奶，奶粉，肉，肝酱，婴儿配方奶粉和罐装婴儿食品中维生素A和维生素E的浓度。采用液相色谱法测定UHT-牛奶和婴儿配方奶粉中维生素D3的浓度。通过分光光度法测定婴儿配方奶粉和罐装婴儿食品中β-胡萝卜素的浓度。

统计分析：使用Excel电子表格处理来自分析的数据。然后评估它们的标准偏差并报告为实验室内重复性评估的百分比相对标准偏差（相对标准偏差％）。

结果和讨论

通过SFE方法和传统有机溶剂方法获得的维生素浓度的比较数据在下表中报告。表1中报告了所有样品中维生素A的浓度。通常，SFE的回收率与传统方法相当，重复性更好（相对标准偏差％）。肝脏中维生素A的回收率为103％。与传统方法相比，奶粉中维生素A的浓度略高，其回收率良好（119％）。SFE提取的液态奶和婴儿配方奶粉中的维生素A低于传统方法。液态奶的回收率仅为67％。可以预测高含水量对提取物的对比度的影响。在维生素提取过程中，限制器可以用水拖出极性化合物（蛋白质，碳水化合物等）。婴儿配方奶粉中维生素A的回收率为54％。在这种情况下，样品的降解可以解释这种特定提取的低效率。

表1：通过超临界流体萃取（SFE）和常规方法测定维生素A.

我们没有在猪肉中发现任何维生素A，因为猪肉中这种维生素的含量非常低，如文献报道和常规方法检测到的那样。罐装婴儿食品中维生素A的浓度低于0.0005 mg/100 g。为了增加维生素A的回收率，要么增加提取时间，要么用酸预处理样品以释放肌肉组织中的脂肪和脂溶性维生素可能有所帮助。

表2中报道了SFE提取的α-生育酚与常规方法提取的α-生育酚的比较。在SFE和文献值之间显示出良好的一致性，SFE的RSD％通常低于常规方法。与传统方法相比，猪肉的回收率为80％。通过用有机溶剂萃取，SC-CO2能够提取在UHT-牛奶中发现的69％。

表2：SFE和常规方法测定α-生育酚

从肝酱中回收α-生育酚为59％，与传统方法相比，来自奶粉的α-生育酚回收率为55％。 罐装婴儿食品的回收率仅为50％，而婴儿配方奶粉只有17％。SFE提取物中维生素E的含量通常低于常规方法。这可能是这种维生素大量降解的结果，并且需要欧盟项目建议的程序的某些变化（例如，样品应储存在193K而不是277K）。

表3：SFE和常规方法测定γ-生育酚

各种食品中的γ-生育酚浓度记录在表3中。与传统方法相比，使用SFE的婴儿配方奶粉浓度为108％，罐装婴儿食品浓度为92％；两个结果都是可重复的。与α-生育酚相比，γ-生育酚的不同行为可能是由于它们的抗氧化活性不同，这与降解速度成正比。

表4：SFE和常规方法测定维生素D3

当使用SC-CO2提取时，发现UHT-牛奶中维生素D3的浓度（表4）低于仪器检测限。与官方方法和文献数据相比，婴儿配方食品中的维生素D3非常高。这可能是由于SFE程序有效性非常快，因此维持维生素D3免受氧化降解和光照。记录的RSD％低于官方要求。

表5：通过SFE和常规方法测定（3-胡萝卜素）

由SFE和官方方法测定的β-胡萝卜素的浓度报告在表5中。尽管在SFE中未在婴儿配方食品中检测到，但是通过常规方法显示。在罐装婴儿食品中，使用SFE发现的日胡萝卜素浓度非常低，RSD％（6％）较高。与维生素E类似，β-胡萝卜素的非常低的回收率可能是由于在提取之前储存的样品中的相当大的降解。几个月前对同一批次的样品进行常规提取。

使用常规方法的相对标准偏差％与SFE获得的相对标准偏差％相当。在任何情况下，RSD％低于美国环境保护局分析物回收控制限值下分析的30％目标性能参数，mg/kg或lmg/ kg浓度范围。美国油脂化学家协会总脂肪测定方法的相对标准偏差％要求表明不同浓度的分析物之间的差异在1.13和4.67％之间。

可以对所描述的方法做出正面评价和负面评价。该方法与肉类，肉类产品，乳制品和婴儿产品的不同基质相容，如本文所示。其他作者也获得了类似的结果，其他关于地中海食品的研究也显示了更多的积极结果，例如萨拉米香肠和巴马干酪。 尽管这是一种快速有效的方法，但也存在局限性。例如，SFE不能充分提取α-生育酚和日胡萝卜素，并且在这些条件下，对样品降解高度敏感。正在进一步研究以研究增加α-生育酚的提取和优化维生素D的提取的最佳方法。

原文标题：《Fat-SolubleVitamin Extraction by Analytical Supercritical Carbon Dioxide》

原文出处：Department of Food Science, University of Perugia,Perugia,Italy

涉及纯化分析产品