临床上口腔黏膜疾病以局部对症治疗为主，研究显示，局部缓释给药是治疗口腔疾病较合理的方法^[1]。在市面上最常见且应用最为广泛的局部缓释给药剂型为膜剂，其具有黏附性好、使用便捷、性能稳定、工艺简便、适用范围广等特点^[2]。

聚电解质复合膜（polyelectrolyte complex films，PCF）是近年来新发展的一种膜剂，属于黏附控释膜，一般是指带有相反电荷的大分子与大分子或者是大分子与小分子之间通过静电吸引力的相互作用所形成的大分子复合网络^[3]，是一种新型高分子复合材料。由于是水不溶性复合物，所以具有缓释的特点，减少了给药次数，同时也提高了病灶部位的有效药物浓度，且制备过程中不使用有毒溶剂或交联剂，对人体基本无害^[4]。

白及多糖（Bletilla striata polysaccharide，BSP）具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种生物学活性^[5-6]。作为天然高分子材料，具有功能缓释性、自身降解性、无毒副作用、廉价易得等特性^[7-9]。研究发现，在牙膏中添加BSP可有效防治咽喉肿痛和口腔溃疡等疾病，并可以有效地抑制口腔细菌的滋生，对改善口腔健康有显著作用^[10]。壳聚糖（CS）是甲壳素的脱乙酰化衍生物^[11-12]。近几年因其黏  膜/生物黏附性在黏膜领域引起了关注^[13]。作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，CS凭借其优异的生物学特性在药物缓释体系、组织工程等应用迅速发展^[14-15]。而实验药物姜黄素（curcumin，Cur）已发现其具有抗炎、抗病毒、抗感染等药理活性，且毒性低、不良反应小^[16-17]。近几年有研究表明Cur对口腔疾病牙周炎^[18]和口腔溃疡^[19]等有显著效果。

本实验采用生物可降解性的BSP和CS为原材料，通过醚化法^[20]对BSP进行羧甲基化改性，使中性多糖带上负电荷，增大了多糖的活性，提高了多糖的药效。羧甲基化法由于其制备简单、成本低、低毒性等优点，已成为一种多糖分子修饰的常用方法^[21]。改性后的BSP与带正电的CS通过静电作用形成聚电解质复合物^[22]。制备用于口腔溃疡应用的载有Cur的羧甲基化白及多糖（CM-BSP）-CS聚电解质复合膜（CM-BSP-CS@Cur PCF），为研发新型口腔溃疡治疗药物准备条件。

1  仪器与试药

1.1  仪器

Lambda 35紫外-可见分光光度仪，Perkin Elmer公司；78HW-1数显恒温磁力搅拌器，杭州仪表电机有限公司；BT125D电子天平，德国赛多利斯公司；透析袋，截留相对分子质量3 500，北京索莱宝生物科技有限公司；FD-1A-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂；黏附力测定装置，实验室自制；水浴恒温振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司；0～25 mm厚度测量仪，温州韦度电子有限公司；Bruker Avance 400MHz核磁光谱仪、VERTEX70显微红外光谱仪，瑞士Bruker公司；S-4800扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.2  试剂

BSP，质量分数90%，西安朗泽生物科技有限公司；CS，脱乙酰度80～95，国药集团化学试剂有限公司；Cur原料药，质量分数98%，批号201406，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；人工唾液，空军军医大学第三附属医院院内制剂；纯化水，实验室自制；其余试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  BSP的羧甲基化

采用醚化法制备CM-BSP。1 g多糖在冰浴条件下加入到20 mL 20% NaOH中搅拌至完全溶解，然后加入30 mL异丙醇继续搅拌30 min，3.25 g一氯乙酸少量水溶解后缓慢滴加，升温至55 ℃搅拌70 min后，加冰醋酸调pH至中性，用截留相对分子质量3 500的透析袋透析3 d后旋蒸浓缩冷冻干燥即得羧甲基化修饰的BSP^[23-24]，即CM-BSP。取代度（DS）为0.84。反应式见图1。

2.2  CM-BSP的DS测定

羧甲基多糖和羟基乙酸在100 ℃的浓硫酸溶液中都可以定量地释放甲醛，甲醛与特定试剂作用显紫色，当羟基乙酸质量浓度在15～100 μg/L时，其溶液的吸光度服从朗伯-比尔定律，适用于任何取代度的羧甲基醚化多糖^[24]。

准确称取羧甲基化多糖10 mg，用0.25 mol/L NaOH溶液溶解，转移至25 mL量瓶中定容（0.4 mg/mL）。取待测样品1mL加入25 mL具塞试管中，加入0.1%铬变酸溶液（100 mg铬变酸置于100mL量瓶中，用10 mL蒸馏水分散后，置冷水浴中用浓硫酸定容）5 mL，1 mL浓硫酸，水浴加热0.5 h，将试管冷至室温，滴加30%乙酸铵溶液，使各具塞试管内溶液至刻度，测吸光度（A）^[23]。按标准曲线所得回归方程计算药物质量浓度后带入公式计算DS。

DS＝162 m/[76－(81－1)m]

m为每克羧甲基糖样品中相当羟基乙酸的量（g），162为多糖的失水葡萄糖（或甘露糖）单元的摩尔质量（g/mol），76为羟基乙酸摩尔质量（g/mol），81为CH₂COONa摩尔质量（g/mol）

2.2.1  检测波长确定  取羟基乙酸显色液及空白液适量，在200～800 nm波长进行紫外扫描。显色液在570 nm处有最大吸收波长且空白液无吸收，因此确定570 nm为DS的检测波长。

2.2.2 线性关系考察  吸取羟基乙酸对照品液（1 mg/mL，纯化水配制）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL具塞试管中，用0.25 mol/L NaOH溶液补足，使其体积至1 mL，然后各加入0.1%铬变酸溶液5 mL，浓硫酸1 mL，水浴加热0.5 h，将试管冷至室温，滴加30%乙酸铵溶液，使各具塞试管内溶液至刻度，显色后溶液为紫色，在570 nm处测定A值。以显色溶液的A值（Y）对其质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝23.611 X＋0.004 5，r²＝0.994 7。结果表明显色液在0.008～0.040 mg/mL与A值呈良好的线性关系，此法形成的有色络合物较稳定。

2.3  CM-BSP的结构表征

2.3.1  CM-BSP的红外光谱（FT-IR）分析 取适量CM-BSP，放入红外光谱仪中，4 000～400 cm⁻¹波数范围内扫描，分辨率4 cm⁻¹，扫描次数32次。结果见图2。FT-IR图谱中出现了新的较强吸收峰，在1 590、1 415 cm⁻¹附近，分别是羧甲基中（C=O）的非对称和对称的伸缩振动引起的；3 300 cm⁻¹附近为多糖-OH的吸收峰，羧甲基化后此峰变得平缓且向高波数方向移动，说明-OH数量减少，都表明了多糖分子中（COO⁻）基团的引入成功，说明多糖分子确实发生了醚化反应。

2.3.2  CM-BSP的¹³C-NMR分析  取适量CM-BSP和BSP测定¹³C-NMR。结果见图3。从BSP的谱图中看出，δ 100.11和δ 76.15分别代表β-1,4-甘露糖的C-1和C-4位置。δ101.26和δ 77.28分别代表β-1,4-葡萄糖的C-1和C-4位置^[8]。CM-BSP相较于BSP¹³C-NMR图明显增加了δ 177.76的峰，归属于羧甲基结构中的-COOH，典型的特征峰证明了羧甲基取代的成功。在CM-BSP的¹³C-NMR谱图中，原未改性的多糖中C-3（δ91.88）峰消失，而在δ 79～85出现的一系列信号峰为C-2、C-4、C-6取代对C-3的影响。说明取代反应在C-2、C-4、C-6位上都有发生。CM-BSP谱图中部分原BSP的C-6信号峰由于羧甲基化而向低场移动，从δ 48.71（C-6）位移至δ 60.75（C-6′），这是由于在C-6上-CH₂COOH基团取代了羟基，C-6从δ 48.71向低场（左区域）转移^[25]。从这些峰的面积来看，对应取代量，羧甲基的引入程度为C-6＞C-4＞C-2。

2.3.3  CM-BSP的扫描电子显微镜（SEM）分析  取适量干燥的CM-BSP于样品台上，置于离子溅射仪中镀一层导电金膜后进行观察，结果见图4。由SEM图可以看出，BSP样品呈片状或碎屑状堆积，表面形貌光滑，无孔洞，呈片状聚合在一起。而CM-BSP呈分散、单片状分布，表明BSP的规则纤维状结构被破坏，结构疏松，变为不规则的层状，并且可看到其表面形状规则的圆形小孔。

2.4  CM-BSP-CS@Cur PCF的制备

称取CS 233 mg，Cur 20 mg，甘油92.5 mg于100mL锥形瓶中，向瓶中加入25mL 0.5%HCl溶液于磁力搅拌器搅拌至完全溶解后用0.25 mol/L NaOH溶液调pH至5.5备用。称取133 mg CM-BSP用25 mL纯化水完全溶解后在超声条件下缓慢将CM-BSP溶液滴加至CS混合液中，将得到的混合溶液倒入聚乙烯培养皿中放入烘箱40 ℃烘干，紫外灯下灭菌15 min后揭取，即得CM-BSP-CS@Cur PCF，避光密封保存。

2.5  正交试验优选CM-BSP-CS@Cur PCF处方

根据文献与反复试验探索^[26-27]，以外观性状、溶胀度、黏附力、载药量及药物累积释放度为评价指标，对CM-BSP与CS的比例、总量及甘油用量以及投药量进行单因素考察。其中CM-BSP与CS的比例、总量以及投药量明显影响着膜剂的性能。CM-BSP与CS的比例选择1∶5、1∶3、1∶2、1∶1.5、1∶1、3∶1进行考察，CM-BSP与CS总量选择200、250、300、350、400、450 mg进行考察，甘油用量选择10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%进行考察，Cur投药量选择10、15、20、25、30 mg进行考察，结果见表1。

最终在单因素考察的基础上笔者选择了CM- BSP与CS的比例（A）、总量（B）以及投药量（C）为考察对象，以黏附力和药物累积释放度为考察指标。采用L₉(3⁴) 正交试验表，直观分析法进行分析。因素与水平见表2，正交试验结果见表2，直观分析结果见表3，方差结果见表4。

2.5.1  外观观察 对所制备药膜肉眼进行观察其柔软性，均匀性，光滑性，揭取难易程度，依据厚度不同，每项得分0～2.5分，计为外观观察值。

2.5.2 黏附力的测定  将待测膜用502胶贴于玻片1上，取新鲜的鸡蛋壳膜用人工唾液浸泡约30 min后，剪取1 cm²用502胶黏贴于玻片2上。用1滴人工唾液将玻片1待测膜表面润湿后，迅速将黏有鸡蛋膜的玻片2覆盖于其上，使鸡蛋膜与药膜紧密接触，同时用100 g砝码压迫5 min。5 min后撤去外力，调整输液流量为2滴/s，称量玻片2脱落时塑料瓶中的水与玻片2的总质量，即为药膜黏附力的大小，黏附力在正交评价中用积分情况表述，以g/cm²计，0～10 g/cm²为1分，11～20 g/cm²为2分，21～25 g/cm²为3分，26～30 g/cm²为4分，31～35 g/cm²为5分，36～40 g/cm²为6分，41～45 g/cm²为7分，46～50 g/cm²为8分，51～55 g/cm²为9分，56～60 g/cm²为10分，计为黏附力值^[28]。

2.5.3  溶胀度测定  膜被剪裁成1 cm²大小，称定质量，放入20 mL人工唾液中，将整体置于在37 ℃，50 r/min恒温水浴振荡器中2、5、10、20、40、60、120、240 min，用滤纸吸干膜表面多余水分，称定质量，按照公式计算溶胀度（SR）。

SR＝(W_t－W₀)/W₀

W₀为干燥膜的质量，W_t为t时刻膜的质量

2.5.4  载药量的测定  取CM-BSP-CS@Cur PCF 0.5 cm²，称定质量后剪碎至50 mL量瓶中，先加入2.5 mL纯化水使其充分溶胀后加无水乙醇至刻度，超声使Cur充分溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过，测定A值，按标准曲线所得回归方程计算药物质量浓度，按公式计算载药量。

载药量＝W_{膜剂中药量}/W_投药量

（1）检测波长的确定：取Cur对照品及空白膜剂适量，用无水乙醇溶解并稀释至适当质量浓度后滤过，在200～800 nm波长进行紫外扫描。Cur对照品在422 nm有最大吸收且空白膜液无吸收，因此确定422 nm为Cur检测波长。

（2）线性关系考察：无水乙醇配制0.1 mg/mL Cur对照品溶液50 mL，加无水乙醇配制成0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL至25 mL量瓶中用无水乙醇定容，分别测定422 nm处A值。以对照品溶液的A值（Y）对其质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y＝146.46 X＋0.016 6，r²＝0.998 5。结果表明Cur在0.8～3.2 μg/mL与A值呈良好的线性关系。

2.5.5  药物体外释放度的测定  在（37±1）℃下在50 mL人工唾液中进行溶解，并以50 r/min振荡。将贴剂（1 cm²）漂浮在溶解介质中，振荡，每隔一段时间取出5 mL溶液，利用紫外分光光度法进行测量并计算溶液中药物的含量。取样后及时补充相应体积的缓冲液。

2.5.6  结果分析 根据表2条件制备CM-BSP-CS @Cur PCF，并测定黏附力与体外累积释放度，结果见表2，方差分析结果见表4。

由表3直观分析可知，A＞B＞C，其中A₂＞A₃＞A₁，B₂＞B₃＞B₁，C₂＞C₃＞C₁，即CM-BSP与CS二者比例对黏附力和释放度影响最大，其次是二者总量，最后是投药量。由表4可以看出，CMBSP与CS二者比例和二者总量对黏附力的影响具有显著性差异（P＜0.05），投药量在所选水平上无显著性差异；CM-BSP与CS二者比例对体外累积释放度的影响具有显著性差异（P＜0.05），二者总量与投药量在所选水平上无显著性差异。因此，最优工艺条件为A₂B₂C₂，即CM-BSP 117 mg，CS 233 mg，Cur 20 mg，甘油用量25%。

2.6  验证实验

结合既定的工艺和参数，按照最佳处方和制备工艺条件，制备3批载药聚电解质复合膜，观察和测定各项指标，结果见表5。由表5可知，在优化工艺条件下的黏附力为10分，平均累积释放度为93.78%，而且较为稳定，其余指标均较为理想，说明该方法可行，工艺的重复性良好。

2.7  CM-BSP-CS@Cur PCF FT-IR分析

取适量CM-BSP-CS@Cur PCF样品，放入FT-IR中，4 000～400 cm⁻¹波数扫描，分辨率4 cm⁻¹，扫描次数32次。结果见图5。CS在1 652、1 598、1 320 cm⁻¹有特征吸收峰，分别代表酰胺I带、酰胺II带、酰胺III带。其中1 652、1 598 cm⁻¹的吸收峰有部分重叠，CM-BSP不对称和对称振动吸收峰分别在1 593、1 417 cm⁻¹。CS与CM-BSP相互作用形成聚电解质复合物后，由于氨基与羧基间离子键及基团间氢键的形成，CS在1 652、1 598 cm⁻¹处的条带重叠，1 320 cm⁻¹酰胺III吸收峰消失。最初存在于CM-BSP中的1 593、1 417 cm⁻¹的峰被扩展并移至1 623、1 417 cm⁻¹。综合显示CS的氨基在酸性条件下变成NH₃⁺，与CM-BSP上的羧基负离子产生强的静电作用而生成聚电解质复合物。

2.8  CM-BSP-CS@Cur PCF SEM分析

取适量膜剂样品于样品台上，置于离子溅射仪中镀一层导电金膜后，进行观察。结果见图6。由SEM图可见，从平面和截面上看CS药膜，CM-BSP和BSP-CS药膜均由规则的、大小均一的颗粒状均匀而密集的聚合在一起；而CM-BSP-CS@CurPCF则具有纤维状的不规则表面和内部结构，不出现相分离。

3  讨论

在单因素考察的基础上，选择对CM-BSP-CS@ Cur PCF黏附力与体外累积释放度影响最显著的因素进行正交试验设计，优选出最佳处方为CM-BSP 117 mg、CS 233 mg、Cur 20 mg、甘油用量25%。通过验证发现该处方与工艺优越、合理、可重复性高，可作为筛选处方和工艺的一种切实有效的手段。

本实验采用生物可降解性的BSP和CS为原材料，通过对BSP进行羧甲基化修饰后与带正电的CS通过-NH₃⁺与-CH₂COO⁻之间的静电作用形成水不溶性的聚电解质复合物，成功制备了用于口腔溃疡应用的载有Cur的CM-BSP-CS聚电解质复合药膜。拓宽了白及多糖的应用范围和口腔溃疡的剂型范围，同时也为其他剂型的开发与应用提供了新的选择与方向。

参考文献（略） 

来  源：王玉蓉，冯  斌，巨  佳，成黎霏，王  济，顾  宜，王晓娟. 羧甲基化白及多糖-壳聚糖载姜黄素聚电解质复合膜的制备及其表征 [J]. 中草药, 2020, 51（4）:978-986.

王玉蓉，王晓娟 中草药杂志社