今天非常有幸邀请到康奈尔大学陈鹏教授课题组的叶溶博士（论文共同第一作者）来对他们最新发布在ACS Catal.上的论文进行解读，在此感谢叶博士的无私分享，叶博士现在是康奈尔大学的校长特聘博士后研究员。

共同一作：Rong Ye, Xianwen Mao

通讯作者：陈鹏教授

DOI:10.1021/acscatal.8b04926

催化通常分为三个领域：均相，多相和生物催化。对于后两者（即生物催化和多相催化），从在农村酿酒厂果实发酵生产葡萄酒和在城市化工厂中生产石油化工产品的场景中可以直观地看出它们的不同。除了实际差异之外，这两个领域共同的技术术语在意义上存在分歧。比如英文中turnover number一词，在酶催化中它是指每秒酶分子转化为产物的底物分子的最大数量，通常写成k_cat;同一用词在多相催化中是指一摩尔催化剂在失活前转化的反应物的摩尔数，通常缩写为TON。

然而，先进的表征工具提供了对这些催化系统越来越深入的理解，揭示了它们内在的相似性。一个明显且重要的相似之处是这些催化剂的大小。酶分子，即生物催化剂的关键组分，典型大小范围从几到~10纳米，而大多数多相催化剂的活性组分是纳米颗粒(NP)，大小约为几纳米到几百纳米。有趣的是，酶和NP的纳米尺寸（即每个酶或NP的数百个或更多个原子）通常与单个酶或NP之间的多样性相关，导致无序（参见下文）。因此，单个酶或NP的一些催化行为通常隐藏在整体平均测量中。然而，由于酶和NP的尺寸很小，在最近单分子技术的出现与发展前，单酶或单粒子尺度的测量十分困难。在本文中我们基于最近的单分子研究讨论酶和NP催化之间的类比。具体而言，我们专注于比较单分子水平的酶和NP催化之间的反应动力学，静态无序，动态无序，平行反应途径和变构效应。

Michaelis-Menten（MM）模型成功地描述了大多数生物催化剂的动力学行为。该模型描述酶E，其与底物S结合，形成复合物ES，其转化为另一种复合物EP，其迅速释放产物P并再生原始酶E（图1A）。 MM机制具有以下近似。首先，催化的限速步骤是从ES到EP的反应。其次，建立了E、S即复合物ES的准平衡。第三，与催化转化率相比，产物P的释放是快速的。在稳态近似下，产物形成速率由下式给出：

其中[S]是平衡中的底物浓度，K_M是MM常数并且具有浓度单位，并且v_max是最大反应速率和[E]_T是总酶浓度。

图1

Xie及其同事在1998年首次报道了单分子酶动力学。从活性位点含有荧光辅因子的酶胆固醇氧化酶的发射强度轨迹，他们实现了在单次催化反应中对酶的氧化（荧光）和还原（非荧光）状态（图1B）的实时观察。氧化态和还原态的每次的等待时间（持续时间）是随机的，但它们的平均值⟨τ_ox⟩和⟨τ_red⟩分别对应于反应速率的倒数。使用这些方法分析β-半乳糖苷酶的单分子催化荧光产物“试卤灵”生成的等待时间，谢和同事在2006年的开创性工作中重新审视了单分子环境中的MM动力学。他们得出结论，单分子酶催化显示出与整体测量相似的饱和动力学（图2A），但是给出了单分子MM方程以强调与常规方法相比的不同微观解释：

其中τ是每个产物生成之前的等待时间。考虑到v_max = k_cat[E]_T，其中k_cat是引言部分中定义的转换数，[E]_T是酶分子的总浓度，将等式1的两边除以[E]_T，即评估每个酶分子的速率，即可得等式2。然而，尽管单一酶的构象不断波动（将在第4节中讨论），单酶中的转换数k_cat和依赖于k_cat的K_M是所有构象异构体的加权调和平均—— 这是单酶MM方程的基本微观解释。

图2

另一方面，NP催化通常可以通过用于多相催化的Langmuir-Hinshelwood（LH）动力学模型来描述。它有以下假设。首先，催化的限速步骤是表面吸附的两个反应物分子之间的反应。其次，建立了反应物吸附的准平衡，吸附符合Langmuir吸附模型。第三，与催化反应速率相比，产物P的脱附比较快。经典的LH模型描述的是双分子反应。然而，当两种反应物吸附到不同类型的表面位点（即非竞争性吸附）并且一种反应物的浓度保持恒定时，所涉及的基本动力学步骤与MM模型相当。在这种情况下，反应物A与表面位点*结合，形成吸附物质A_ads，其转化为吸附产物P_ads，其迅速释放产物P并再生表面位点*（图1C）。

Chen及其同事使用金NP作为模型催化体系，在2008年首次发表了关于单一NP催化剂单次转换的实时观察。从金NP催化羟胺对刃天青的还原生成荧光产物“试卤灵”的发射强度轨迹，他们实现了单粒子催化的实时单周转检测（图1D）。类似地，这些随机荧光脉冲之间的等待时间和持续的等待时间分别为τ_cat和τ_des，可用于分析反应动力学。对许多等待时间求平均得出产物形成速率⟨τ_cat⟩^-1，其遵循饱和动力学（图2B）。⟨τ_cat⟩^-1与[A]的关系遵循单分子LH方程：

其中K₁是反应物吸附平衡常数并且具有浓度倒数的单位，并且γ_eff表示在一个NP上的所有表面催化位点的反应性总和。

从图2A，B可见，当[S]≪KM或[A]≪1时，反应速率随底物或反应物浓度[S]或[A]线性变化（即准一级动力学）。 然而，当[S]或[A]变得足够大以支配分母时，反应速率与底物或反应物浓度无关，并且反应表现出零级动力学，因为所有酶或表面位点都在这些条件下被占据。饱和反应速率取决于每个活性位点的反应性以及可用酶位点（即单体或低聚物）或表面位点的数量。酶催化和NP催化之间的相似饱和动力学归因于两个单分子方程式的形式相似性。将等式1和2重写为传统Lineweaver-Burke图的倒数形式，⟨τ⟩-vs- [S]^-1和⟨τ_cat⟩-vs- [A]^-1遵循线性关系（图2A、B的插图）。

无论是静态还是动态的无序都是酶和多相催化中普遍存在的现象。静态无序是指各个酶分子或催化剂颗粒之间反应性的静态多样性。静态无序与动态无序不同，动态无序是单个酶或颗粒的催化活性随时间的波动，这将在下一节中讨论。

静态无序通常在集合测量中被掩盖，但在单酶或单粒子测量中可直接观察到。正如他们的名字所暗示的，单酶或单粒子研究揭示了单个酶或颗粒的催化行为，因此不同个体之间的比较变得简单直接。通过与底物/反应物浓度无关，且与时间无关的动力学参数的分布可以恰当地揭示静态无序，即酶的k_cat和NP的γ_eff；这两个参数可从如图1B，D中的那些荧光强度轨迹里的平均微观等待时间用公式求得（每个酶分子或NP对应一条轨迹，每一条轨迹求得一个k_cat或γ_eff数值）。统计同一批样品中的多个k_cat或γ_eff发现它们取值的多样性，明确地分别验证酶或NP的静态无序（图3A，B插图）。

图3. 

酶和NP的静态无序的原因是高度类似的。由于催化剂的结构决定了它们的内在催化性质，静态无序意味着各个酶/NP之间结构的多样性。与常见的小分子有机金属化合物（典型的均相催化剂）不同，其分子结构通常可以精确复制并保持良好，酶和NP在表达或合成和储存过程中易受其结构变化的影响。比如由于不同NP之间的成核和生长历史的区别，NP的大小和形状的分散性是众所周知的。Chen及其同事甚至确定了沿纳米棒或纳米板从中心到边缘的反应梯度（即亚粒子水平的静态无序），这可能源于由相同NP的中心到边缘的不同生长速率引起的表面缺陷密度的梯度。在金属NP催化剂之外的纳米材料中也观察到静态无序，例如，层状双氢氧化物，碳纳米管，半导体和合成沸石。

静态无序将各个催化剂单元在同一段时间的性质相互比较，而动态无序是指一个催化剂单元在与周转周期相当或更长的时间尺度下的时间波动。静态和动态无序通常同时存在，导致整体的催化特性的广泛分布。由于其非同步特性，使用集合平均实验探测动态无序并将其从静态无序的影响中区分出来，是非常具有挑战性的，并且超出了传统化学动力学的范围。然而，从单分子轨迹中可直接、便捷地表征动态无序。

图4. 

动态无序通常表现为单一酶或NP的记忆效应；例如，对于催化动力学，周转率取决于其先前的周转。因此，动态无序最好通过催化转换的微观等待时间τ的自相关函数C_τ（m）来证明。对于图1B，D中单个酶和单个NP的转换轨迹，它们的C_τ（m）显示出明显的指数衰减行为（图4A，B）。指数衰减时间常数给出相应的波动相关时间，即动态无序的记忆时间。

酶和NP中动态无序的物理起源在概念上是等同的。酶活性波动起源于酶分子的缓慢构象变化（图4C），其可以跨越0.001至10s的时间尺度。类似地，NP的动态无序归因于动态表面重组（图4D）。动态表面重组的一个依据是被催化诱导的表面重组可导致波动速率（即波动相关时间的倒数）增加。注意NP的动态无序仅在小NP上表现出来，因为其波动时间尺度与催化动力学的特征时间尺度相当。当NP很大时，这种波动变得太慢而不影响催化速率。 Chen及同事进一步证明，NP动态无序的时间尺度取决于NP的大小和化学成分（Pt与Au）；这两个观察结果都与一个众所周知的事实相一致，即表面重组动力学依赖于NP的表面能，而NP的表面能取决于其尺寸和组成。

由于酶和NP中普遍存在静态和动态无序，如第3节和第4节所述，两种系统都倾向于表现出多种反应途径。例如，酶的构象变化可以与不同的产物释放途径相关联，而NP的内在结构异质性使得它们在单个催化剂颗粒之间显示出不同的催化机制，或甚至在单个颗粒的不同位点之间显示出不同的催化机制。阐明复杂的反应途径，包括在集合测量平均中分析酶分子和NP的隐藏结构变化，以及来自不同反应途径的不同瞬态物种，是一项挑战。单分子方法在探讨单个酶或NP时具有独特的优势，因此，是提供解开可能的平行反应途径的有力手段。

图5. 

Lu和同事结合单分子光子时间戳光谱仪和磁力镊子对单一酶施加受控的机械力，报道了一项关于具有血红素修复基团，辣根过氧化物酶（HRP）的常见单体酶的构象动力学及其对荧光反应的催化机制的研究。他们在产物分子试卤灵从酶活性位点释放的过程中，发现了两种不同的HRP构象状态（图5A，上图）:（i）紧密结合状态，将产物分子限制在酶催化袋内，可能是由于产物分子和酶之间的强静电相互作用和其他相互作用，以及（ii）对应的松散结合状态，开放酶活性位点以将产物分子释放到周围溶液中。在对酶的外部的皮（10^-12）牛顿的拉力下，产物释放途径主要是与活性位点的松散结合状态相关的途径（图5A，底部）。这一发现在酶催化中具有广泛的相关性，因为酶的构象动力学已显示出对反应动力学具有显着影响。更相关地，酶的瞬时、中间构象状态的形成已经在酶促催化的产物释放步骤中被实验观察到。

关于NP催化，使用单分子催化成像技术，Chen及其同事已经表明，由于它们的结构多样性，各个金 NP在荧光探针反应（由弱荧光的刃天青生成荧光的试卤灵）的催化过程中表现出不同的动力学机制（图5B）。实验观察到三种不同类型的反应物浓度[A与产物解离速率⟨τ_des⟩^-1关系的曲线（图5B，插图），并且可以通过等式4描述：

由于在金 NP上存在两个不同的产物解离途径，如图5B所示，产物解离速率可能显示三种不同的动力学行为：（I）如果k₂>k₃，产物解离速率随[A]单调递增，（II）如果k₂<k₃，产物解离速率随[A]单调递减；（III）如果k₂=k₃或K₂ = 0, 产物解离速率不随[A]变化。三种不同的行为在两个速率常数的相对大小上不同，反映了NP个体对这两种平行的产物解离途径的不同选择性。 Chen组的另一项工作揭示了在金NP催化过程中对产物解离反应的选择性受NP颗粒尺寸影响，进一步突出了原位单分子催化方法在探测基本反应机理和提供可能的平行反应的确切证据方面的实用性。

变构效应（Allostery）是一种现象：在大分子的活性位点处的分子的结合或反应的发生影响在一定距离的另一个位置处的结合或反应。这种现象表明了远距离的合作通信。在生物系统或过程中（例如酶催化，蛋白质功能和DNA-蛋白质相互作用）变构效应早已被记载。通常，变构效应是酶和蛋白质的典型特质，它们在结合小分子或配体时常常经历显著的构象变化。

报道变构效应的大多数工作是在集合水平上进行的。例如，酶促催化中的一种经典方法是研究反应速率和底物浓度之间的关系，而S形的关系意味着催化变构效应。然而，集合水平的研究不包含任何空间信息，因此不能提供分子结合或反应的空间相关性的知识，而这变构效应的核心内容。单分子方法可以提供直接的空间信息，因此非常适合探测变构效应。

图6. 

Xie及其同事报道了一项关于DNA-蛋白质相互作用中的变构效应的单分子研究，并提供了明确的实验证据证明DNA结合蛋白的解离速率受到远处另一个蛋白质分子结合的影响。他们发现DNA结合蛋白GRDBD（即糖皮质激素受体的DNA结合域）的解离速率表现出明显的振荡模式，这是该蛋白结合位点与远端另一种蛋白质的结合位点之间的碱基对数（L）的函数（图6），其中振荡周期约为10个碱基对。DNA分子的这种变构效应是由其主沟槽的变形引起的。使用分子动力学模拟，作者表明，两个不同位置处的主沟槽宽度（R）（图6B插图）之间的空间相关性函数显示出具有约10个碱基对的周期性的振荡模式（图6B） ，与动力学测量中观察到的一致（图6A）。图6C可以更清楚地说明两种DNA结合蛋白A和B之间的变构偶联。假设蛋白质B扩大R，它更喜欢在已经被蛋白质A加宽的位置结合，而不是在变窄的位置结合。

直到最近，这种变构效应是否也存在于非生物系统中尚不清楚。Chen及其同事最近的一份报告显示，非生物纳米催化剂确实表现出这种协同效应，其在现象学上类似于酶中的催化变构效应。利用通过时空解析单分子催化成像的能力，他们已经证明，单个纳米催化剂上的催化反应在数百纳米的距离上具有正相关性，并且具有约10至100秒的时间记忆。荧光产物分子在各个钯纳米棒上的空间映射允许将每个纳米棒解剖成空间上不同的区段（图6D）。此外，可以从每个区段中提取产物生成事件的时间序列。一个惊人的发现是，通过单个“事件对”的相关性分析，量化的“粒子内催化通信的强度”始于明确的正值，并且随着粒子内空间间隔、或（时间上随后的产物生成事件之间的）时间间隔增加呈指数衰减（图6E）。这种趋势表明，在一个区段的快速反应往往伴随着附近的另一个快速反应，导致这些反应之间的正协同作用。换句话说，单个纳米催化剂内的反应确实彼此连通。

虽然在现象学上它类似于酶催化中的变构效应，但是NP催化中的这种协同性源于与生物系统不同的机制（即，通过在远处位置结合分子诱导的酶的构象扰动）。在该研究中研究的纳米催化剂的颗粒内催化通信被鉴定为源自带正电的信使物种的迁移，可能是表面空穴（例如，位于金属氧化物物种上）的正电荷（图6F），而其他合理的原因例如反应散热，表面重组动力学和表面等离子体共振（对于Au催化剂的情况）已经通过对照实验或模拟排除。

我们从单分子角度讨论了酶和NP催化之间的概念类比。动力学模型和得到的方程具有相似的形式。由于酶或NP中的内在结构多样性和随时间变化的结构动力学，两种催化体系都涉及静态和动态无序，并且因此表现出复杂的反应机制，其通常以多个平行反应途径为特征。更值得注意的是，长期以来已知在酶催化中具有区别特征的催化协同作用也存在于NP催化中；然而，NP催化中的这种协同作用源于与酶催化中不同的机制。单分子荧光成像技术确实是揭示酶和NP催化的内在特性的有力方法。

叶溶，博士毕业于加州大学伯克利分校(师从国际催化大师Gabor A. Somorjai), 叶博士现在是康奈尔大学的校长特聘博士后研究员。

陈鹏（Peng Chen）教授是康奈尔大学Peter J. W. Debye化学教授。他在斯坦福大学化学系获得了生物无机/物理无机博士学位后，在哈佛大学与Sunney Xie教授在单分子生物物理学方面进行博士后研究。2005年开始在康奈尔大学工作。Peng Chen教授课题组开发并应用单分子方法来探索和理解纳米材料和生物大分子的功能和动力学，目的是获得基础化学知识，以开发更好的能量转换策略以及治疗和预防疾病。