近年来，SuFEx反应作为一种多功能工具在生物特异性化学领域迅速兴起，能够在硫氟化物与亲核官能团之间实现选择性的分子间共价连接。通过遗传编码或者化学修饰的方法，SuFEx反应基团已被成功引入蛋白质和小分子药物中，并实现了与多种生物大分子（如蛋白质、RNA和糖类）的共价连接。这种共价结合可将药物持久性地锚定在靶标分子上，从而增强药物的作用强度。目前，基于SuFEx反应的蛋白质之间的共价交联效率仍然有限，为了提高整体共价交联效率，已有研究者尝试通过改造SuFEx反应基团结构，或优化SuFEx弹头附近微环境等策略加以优化。然而，目前可用于增强蛋白质类药物共价结合性能的手段仍相对有限，开发新的策略以进一步提高其共价交联效率和治疗潜力具有重要的研究意义。

上海交通大学化学化工学院颜德岳院士联合生命科学与技术学院夏小霞教授，夏雪霖助理研究员团队开发了一种双价亲和蛋白药物，实现了对HER2/EGFR双受体的协同共价靶向（图1）。通过多价相互作用机制，双价亲和蛋白药物与靶蛋白的共价交联效率显著增强。在12小时内，该药物与靶蛋白的共价结合效率可达到约80%；相较于两个单价对照组，共价结合效率分别提高了440%和629%。进一步研究表明，与两个单价对照组相比，该药物在8小时内的细胞摄取量分别提高了3.0和2.9倍，且给药5天后，其在体内肿瘤组织中的滞留时间分别延长了4.0和4.6倍。在HER2/EGFR阳性的胰腺癌模型中，双价亲和蛋白药物表现出卓越的抗肿瘤效果，其肿瘤抑制率高达90.4%，显著优于两个单价对照组（59.3%或61.6%）。综上所述，基于SuFEx反应的双靶点共价靶向策略，为共价蛋白药物的设计与开发提供了一个极具前景的平台。

作者首先设计了非共价亲和蛋白药物AAA-PE24（25/17Cys），其包含以下三个核心功能模块：1）主动靶向模块：HER2/EGFR双靶向配体区（分别在Z_HER2:342的第25位和Adnectin的第17位引入Cys突变（图2a、b）；2）延长半衰期模块：白蛋白结合结构域（ABD035）；3）抗肿瘤模块：免疫毒素PE24（图2c）。随后，通过硫醇-马来酰亚胺加成反应，将SuFEx弹头（MFS）高效偶联至AAA-PE24（25/17Cys）的第25位和第17位Cys残基上，构建双价亲和蛋白药物AAA-PE24。Western blot结果显示，单价亲和蛋白药物（Affi-PE24或Adn-PE24）与靶蛋白（HER2或EGFR）形成单一共价交联条带，而双价亲和蛋白药物（AA-PE24或AAA-PE24）则出现两条共价交联条带，证实了双价结合策略的有效性（图2d、e）。图2f的结合指数（CI）结果表明，双价亲和蛋白药物能够通过多价相互作用介导的协同效应增强药物与靶蛋白结合的亲和性，进而促进二者之间的SuFEx反应，最终显著提高了药物与靶蛋白的共价结合效率。

在体外评估实验中，相比于两个单价对照组，双价药物组在细胞内的摄取效率更高，表明双价结合策略显著增强了亲和蛋白药物被细胞摄取的能力（图3a）。图3b的共定位分析结果表明，AAA-PE24与受体结合后，可被转运到内体环境中释放出PE24，并途径内质网，最终到达细胞质，发挥抗肿瘤活性。进一步的CCK-8、克隆形成、凋亡等实验结果表明，双价结合策略能够有效增强亲和蛋白药物在体外的抗肿瘤活性（图3c-f）。

在体内评估实验中，双价结合策略显著提高了亲和蛋白药物在肿瘤部位的富集能力和滞留效果，进而增强了药物对小鼠肿瘤生长的抑制效果（图4）。简而言之，通过化学修饰将共价反应弹头引入多价相互作用药物体系，有望为开发新一代共价增强型靶向药物提供新思路。

Synergistic SuFEx-Driven Covalent Cancer Therapy Using a HER2/EGFR Bivalent Affinity Protein Drug

Wenhui Gao, Chuangchuang Zhang, Xiaoyuan Yang, Yingchun Liu, Yao Wang, Mengqiao Zhao, Xiao-Xia Xia, Wei Huang, Xuelin Xia, Prof. Deyue Yan

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202517155