分享一篇最近发表在JACS上的文章，题目为Chemoselective Tagging of Protein Methacrylation。文章的通讯作者是来自武汉大学的陈素明教授。

    蛋白质赖氨酸甲基丙烯酸化（Kmea）是一种与表观遗传调控相关的蛋白质后修饰（PTM）现象，其广泛存在于细胞核的组蛋白（histone）上。与其余乙酰化现象类似，如巴豆酰化（Kcr），Kmea组蛋白能阻止溴结构域（bromodomain）因子与染色质结合，进而维持染色质的活化状态。研究Kmea及其调控因子能够建立起代谢通路和表观遗传调控之间的“桥梁”，但是如何识别Kmea存在不小挑战。

    化学选择性标记策略能够引入较少的干扰，同时能高效分析蛋白组PTM现象，目前已被应用于多种蛋白质PTM分析中。然而，针对Kmea的选择性标记方法目前未见报道。如示意图1所示，本文中作者开发了具有高选择性的光催化硫醇-烯烃Michael（thia-Michael）加成标记方法，其可以共价连接至Kmea蛋白上，且不受蛋白Kcr的影响。进一步，作者建立了基于化学选择性富集和质谱（MS）方法的工作流，其能精准识别细胞中Kmea蛋白质。基于这一技术，作者首次发现了若干Kmea核蛋白，为理解Kmea的生物学功能提供了重要信息。

示意图1. 光催化thia-Michael加成反应用于Kmea蛋白质标记。

    如图1所示，在光照下，硫醇失去氢原子生成硫自由基。作者设想，相比Kcr，Kmea的位阻更小，且硫自由基进攻Kmea双键后能够得到更稳定的叔碳自由基，因此光催化thia-Michael反应有望实现选择性加成Kmea。为此，作者利用N-(3-二甲基氨基)丙基甲基丙烯酰胺（化合物1a）和4-甲氧基苯硫醇（化合物2，MeOPhSH），设计了模型反应进行验证。液相色谱-质谱联用（LC-MS）表征表明，2.5 h后，该反应产率达到90%，且主要产物为3a。后续实验和密度泛函理论（DFT）计算均表明，MeOPhSH只能和Kmea双键反应，而无法与Kcr双键反应，这验证了该思路的可行性。

图1. Kmea标记反应设计。

    如图2所示，作者设计了Kmea探针azDSH，它由苯硫酚、天冬氨酸连接子和叠氮官能团组成。为避免硫醇在空气中被氧化，作者将其改造成二聚体前体Pro-azDSH，使用时只需使用三(2-羧基乙基)膦（TCEP）等当量还原即可。他们首先合成了甲基丙烯酸化的溶菌酶Kmea-LYZ（化合物1b），随后加入azDSH反应40 min。MS表征表明，所有Kmea基团均被反应，生成产物7a和副产物7b。这表明，azDSH探针具有优异的反应活性和化学选择性。

图2. Kmea探针设计和Kmea蛋白标记。

    如图3所示，为验证azDSH的荧光标记和位点识别能力，作者额外合成了Kmea和Kcr的牛血清白蛋白（Kmea-BSA、Kcr-BSA）。随后，作者将Kmea-BSA、Kcr-BSA、Kmea-LYZ和Kcr的溶菌酶（Kcr-LYZ）四个蛋白与探针azDSH反应，进一步利用铜催化的叠氮化物-炔烃环加成（CuAAC）反应偶联荧光基团。Kmea-LYZ和Kmea-BSA中均检测到较强的荧光信号，而Kcr的两种蛋白均没有荧光产生。进一步，作者利用液相色谱-串联质谱联用（LC-MS/MS）技术，检测了Kmea-LYZ和Kmea-BSA中azDSH标记的具体位点。结果显示，5/5和24/49个Kmea位点被成功识别，表明该方法具有高效性和高选择性。

图3. azDSH用于蛋白质甲基丙烯酸化和巴豆酰化的标记和识别。

    如图4所示，作者开发了基于化学选择性富集和MS的Kmea分析工作流，并将其用于识别牛胸腺和HeLa细胞中组蛋白蛋白组的未知Kmea修饰位点。作者首先提取出对应的组蛋白蛋白组，利用azDSH标记，再利用CuAAC反应偶联生物素。随后，作者使用链霉亲和素（streptavidin）珠富集Kmea蛋白，最后利用LC-MS/MS表征。借助这一工作流，作者成功识别了牛胸腺细胞和HeLa细胞中若干与基因转录、生化代谢和通路调控相关的Kmea蛋白质。上述结果表明，基于azDSH探针的标记方法能够有效识别生物体中Kmea蛋白。

图4. 组蛋白蛋白组中Kmea位点的识别。

    总结来说，作者开发了一种新型的化学选择性标记方法，首次实现了Kmea修饰蛋白的标记和识别。这一方法为Kmea蛋白的研究提供了新的技术手段，有望促使Kmea成为表观遗传调控中新的研究目标。

作者：CHR  审校：QJC

DOI: 10.1021/jacs.5c13826