Angew. Chem. :基于“突变景观”的L-苏氨酸醛缩酶工程改造揭示了遵循Prelog规则的碳-碳键不对称合成机制

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L-苏氨酸醛缩酶(LTA)是一种磷酸吡哆醛(PLP))依赖酶,它能催化甘氨酸和醛生成多种具有两个手性中心的β-羟基-α-氨基酸。β-羟基-α-氨基酸是一类重要的手性中间体,广泛应用于药物合成领域,如氟苯尼考、氯霉素和屈昔多巴等。然而,野生LTA对β-羟基-α-氨基酸的β碳原子非对映体选择性低,阻碍了其工业化应用。



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图1 L-苏氨酸醛缩酶催化合成手性β-羟基-α-氨基酸

近日,浙江大学化学工程与生物工程学院吴坚平教授和于浩然研究员以Cellulosilyticum sp来源的L-苏氨酸醛缩酶(CpLTA)为研究对象,以催化对甲砜基苯甲醛(MTB)和甘氨酸(Gly)生成L-syn/anti-对甲砜基苯丝氨酸(L-syn/anti-MTPS)为模式反应,在突变景观(mutability landscape)的指导下使用CAST/ISM策略进行酶分子工程改造,实现了该酶非对映体选择性的提升和反转。获得的突变体H305L/Y8H/V143R对l-syn-MTPS的非对映体选择性从37.2%syn 提高至 99.4%syn突变体H305Y/Y8I/W307E对l-anti-MTPS的非对映体选择性反转至97.2%anti。

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图2 CAVER3.0预测的底物通道

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图3 L-苏氨酸醛缩酶的非对映体选择性机理

作者随后进行了拉伸分子动力学模拟(multidirectional steered molecular dynamics),解析了该酶的底物进出双通道与非对映体选择性的关系。结果表明,底物从anti式通道进入活性中心时,形成anti式产物,而当底物从syn式通道进入活性中心时,形成syn式产物(图3A)。


最后,作者应用Prelog规则解释了LTA非对映体选择性的形成机理(图3B)。当Cα负离子的电子攻击底物醛re-face,形成anti式产物。相反,当Cα负离子的电子攻击底物醛的si-face,形成syn式产物。研究发现,路径假说和Prelog规则对指导转醛酶、转酮醇酶等催化碳-碳键不对称合成酶的立体选择性改造具有普适性。该研究为后续开发更多的碳-碳键不对称合成酶的非对映体选择性改造策略提供了理论基础,有助于推动生物催化碳碳键不对称合成的工业化应用。

文信息

Mutability Landscapes-Guided Engineering of L-Threonine Aldolase Revealing the Prelog Rule in Mediating Diastereoselectivity of C-C Bond Formation

Dr. Wenlong Zheng, Dr. Zhongji Pu, Lanxin Xiao, Prof. Gang Xu, Prof. Lirong Yang, Prof. Haoran Yu, Prof. Jianping Wu

论文第一作者为浙江大学杭州国际科创中心博士后郑文隆、蒲中机,共同通讯作者为浙江大学化学工程与生物工程学院吴坚平教授和于浩然研究员。


Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202213855




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