唐本忠院士/薛雪研究员《自然·通讯》:促进分子运动以开发用于检测脑炎中一氧化氮的开启型光声生物探针!

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一氧化氮(NO)是在许多疾病中过表达的重要信号分子,因此NO可活化探针的开发对于监测相关疾病具有至关重要的意义。光声(PA)成像是一个新兴的生物医学成像技术,其依赖于通过光学地激发组织或造影剂的热弹性膨胀产生的超声信号。援用光学分辨率和穿透力的声音深度的好处,PA技术,能够以高空间分辨率和实时监控深层组织成像,呈现巨大临床转化潜力。基于小分子和聚合物有机PA成像剂已捕获强烈关注,因为它们具有固有的优点,如良好定义的结构,规模化生产,易用性,修改,以及良好的生物相容性。但是,尚未开发出用于检测与NO相关的复杂疾病(例如脑炎)的灵敏(PA)探针

近日,香港科技大学唐本忠院士和南开大学薛雪研究员团队报告了一种通过调节分子几何结构和能量转化过程在体内检测脑炎的NO活化PA探针。经过NO处理后,可以获得强大的结合增强的供体-受体结构,以及主动的分子内运动,显着增强了“开启”近红外PA性能。分子探针对NO的干扰反应物具有较高的特异性和敏感性。该探头能够以高时空分辨率检测和区分不同严重程度的脑炎。相关工作以“Facilitation of molecular motion to develop turn-on photoacoustic bioprobe for detecting nitric oxide in encephalitis”为题发表在《Nature Communications》上。

【NO探针的设计与合成】
辛氧基取代的三苯胺(OT)用作施主单元,具有强大的供电子性能和更高的溶解度。平面噻吩(T)环既充当供体,又充当π桥单元,可进一步增强电子给体能力并促进分子内电荷转移。的二胺-苯并噻二唑取代的(AB)被选择作为反应可调受体芯因为ø -phenylenediamino组可以与NO反应,得到三唑产物。结果,电子不足的5 H-[1,2,3] triazolo [4',5':4,5]苯并[1,2- c ] [1,2,5]噻二唑(TB)结构形成,这使得D–A更强互动和ICT效应。由于噻吩和受体核之间的位阻不同,NO处理后分子的几何形状也有望发生变化。此外,长脂肪链被设计为保持所述缀合的主链之间的一些灵活的空间,这将是在聚合状态(例如,纳米颗粒)的分子内运动有利。三苯胺的扭曲苯环也将有利于分子内运动。在此,设计并合成了D-(NO可活化的A)-D型探针(OTTAB)。
用于体内NO检测的开启式PA探针
【NO处理前后的光物理性质】
长波吸收峰从459 nm移至686 nm,从而具有明显的开启NIR PA信号。应注意的是,OTTTB表现出3.16×10 4  M -1  cm -1的高吸收系数,这是由于平面共轭核结构并且将确保强的PA产生特性。OTTTB的NIR吸收带可以被分配到强d-A相互作用的有效ICT效果。为了研究聚集状态下的分子内运动,将水逐渐添加到THF溶液中,并记录了PL光谱。OTTAB的PL强度先下降,然后随水的含量逐渐增加,代表一种AIE特征。相反,在高水份中,OTTTB只能观察到非常弱的PL信号,这表明分子内运动在聚集态下很强烈,激发态能量通过非辐射衰减消散。此外,随着水分数的增加,OTTTB红的最大PL从851nm逐渐转变为933nm,证明了在高极性环境中典型的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应。因此,聚集体中形成了黑暗的TICT状态,其中主动的分子内运动将促进非辐射弛豫以生成PA信号。OTTAB和OTTTB的不同光物理行为可能是由于结构变化所致。
NO处理前后的光物理性质
进行了密度泛函理论(DFT)计算以研究分子的几何形状。随着氨基和噻吩间隔基之间的位阻变得更高,受体核和噻吩环之间的二面角从OTTAB的38.5°和36.7°降低到OTTTB的2.8°和15.9°。NO处理后获得的平面结构可实现更好的共轭和更有效的ICT,从而吸收新的NIR。结果,NO处理的分子结构的显着改变导致明显的光物理能量转换过程,其中OTTTB的最大非辐射过程将增强开启PA性能。OTTAB和OTTTB的电子带隙分别为2.57和1.67 eV。最高占据分子轨道(HOMO)能量级略有增加(从-4.43至-4.40 eV),而最低未占据分子轨道(LUMO)能量级降低很多(从-1.86至-2.73 eV)。D‒A型化合物的HOMO和LUMO能级通常分别与供体和受体部分的电子性质有关。因此,该结果证实了通过NO处理激活了受体核的吸电子性能,并且实现了强的D‒A相互作用。
NO处理后分子构象和能级的变化
【NP的制备和表征】
为了使疏水性化合物具有良好的水溶性和生物相容性,OTTAB在1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N- [甲氧基-(聚乙二醇)-2000](DSPE- PEG 2000)和纳米沉淀法。疏水分子在核中是自组装的,两亲脂质-PEG聚合物起表面层的作用。应当指出,DSPE-PEG中的长烷基链可能与OTTAB中的辛基取代物缠结,这使被包裹的NP具有一些有益于自由移动的柔性域。有机NP是一种球形结构,平均直径为142 nm。由于有机探针的疏水性,所包封的NP在水性介质中非常稳定,并且在环境条件下保存两周后直径几乎没有变化。此外,NP在不同条件下也表现出良好的稳定性,这些物质在体内具有潜在的应用前景。NP在600-800 nm的光谱区域中具有很强的吸收能力,该光谱区域位于市售PA仪器(680-950 nm)的激发范围内。OTTAB NPs表现出强发射,而在NO处理后只能观察到非常弱的PL信号,这表明由于更加平坦的结构和减小的带隙,辐射过程受到了极大的抑制。
NP的表征和反应性
【纳米探针的体外PA反应】
经NO处理的OTTAB NP的PA光谱与吸收曲线一致,表明PA信号确实来自OTTTB的NIR吸收。该探头显示出相当稳定的PA信号,因为在暴露于脉冲激光后,PA幅度的变化可忽略不计,远胜于临床使用的吲哚菁绿。这验证了探头对PA长期成像的出色稳定性和适用性。通过记录不同浓度的经NO处理的OTTAB NP的PA强度,可以进一步研究PA信号的结果,并观察到PA振幅与探针浓度之间的线性相关性。通过用不同浓度的NO处理测量PA响应来检查探针的NO检测能力。在相对较低的NO浓度(<2.5 µM)中观察到良好的线性关系,而当进一步增加NO浓度时,反应趋于饱和。
NO的体外检测
【脑炎的体内PA显像】
在此,用LPS预处理小鼠脑的右侧脑室,而用盐水处理脑的对侧半球作为对照。OTTAB的NP溶液侧脑室注射来研究用于体内检测NO相关的脑炎的可行性。用700 nm激发对具有完整颅骨的小鼠大脑进行PA成像。整个小鼠大脑的代表性PA图像清楚地表明,在注入纳米探针后,只有发炎的部位显示了点亮的PA信号,表明探头具有明显的开启PA特性。NPs给药后,立即注射LPS和注射生理盐水的间隔均显示微不足道的PA信号,这表明LPS或生理盐水处理不会产生明显的信号干扰。发炎的右心室的PA强度随时间迅速增加,并在8 h达到最大值。相反,在整个实验过程中,经盐水处理的左心室的PA信号几乎没有变化。定量分析进一步表明,发炎后的心室的PA强度在给药后4和8小时分别比对照左心室的PA强度高约5和17.7倍,表明OTTAB NP可以敏感地监测脑炎内源性产生的NO。
为了进一步探索PA纳米探针在脑炎评估中的实用性,使用了各种LPS(1、10、100、500和1000 µg kg ‒1)来激发小鼠脑部的炎症反应。随着用于治疗的LPS剂量的增加,大脑的iNOS mRNA水平急剧上升。对正常和发炎的脑组织进行的免疫荧光染色分析还显示,发炎的脑中iNOS表达水平远高于正常人。大脑中的PA强度随着注入的LPS浓度而不断增强,并且从用较高量的LPS预处理的大脑中观察到明显更强的PA信号,这可能是由于较高的LPS浓度可导致更严重的脑炎。该结果与iNOS表达和NO浓度的变化良好地相关,因此建立了“脑炎严重程度-iNOS水平-NO浓度-PA强度”的关系。此外,OTTAB NPs处理的小鼠大脑的苏木精和曙红(H&E)染色没有明显的副作用,表明体内生物相容性良好。
脑炎的体内PA显像

总结: 在这项工作中,开发了一种具有开启式PA 的NO探针,用于无创性体内检测脑炎中的NO。NO处理后,OTTAB探针的分子结构和光物理转变过程发生了很大变化,这导致了强大的NIR吸收带和PA信号的开启输出。具有最大能量转换功能的可NO激活的PA探头可实现高信噪比。此外,在黑暗的TICT状态下的扭曲和柔性的烷基取代基极大地促进了NP中的分子内运动,因此吸收的光可以最大程度地转换为声信号,从而显着增强纳米探针的PA效应。与其他干扰反应物种相比,该探针对NO表现出出色的灵敏度和选择性。此外,有机纳米探针显示出良好的生物相容性,并且在体外和体内测试中均未观察到副作用。用该探针进行的非侵入性体内PA成像可以以高对比度的方式检测脑炎中的NO。该探针还能够区分不同严重程度的脑炎,有利于了解疾病的演变过程和药物筛选。充分利用NP中分子内运动的设计策略将为更敏感生物探针的开发提供启示

来源:高分子科学前沿


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