人激素前列腺素G2和H2（PGG2和PGH2）、植物源性抗疟药物青蒿素和一些微生物天然产物中含有生物活性结构环二烷基过氧化物（内过氧化物）。迄今为止，研究在内过氧化物组装时催化的酶都涉及到在底物的碳自由基和附近烯烃之间捕获O2。碳自由基是通过氢原子（H•）从底物转移到由铁辅因子产生或由铁辅因子产生的氧化酶中间产物而形成的。已知的内过氧化物酶催化途径需要多个氢原子转移（HATs）。铁（II）和2-氧戊二酸依赖性Verruculogen合酶（FtmOx1；EC 1.14.11.38）介导来自fumitremorgin B中的脂肪碳C21的HAT，通过C21自由基（C21•）捕获O2，添加过氧自由基（C21−O−O•）到烯烃碳C27，然后HAT到生成的C26•。最近的研究表明，从C21到C26的HATs过程中，FtmOx1酪氨酸残基Tyr224和Tyr68的作用相互冲突。
图片来源：ACS Catal.
有鉴于此，The Pennsylvania State University的J. Martin Bollinger, Jr.及其合作者利用非天然氨基酸环卤代酪氨酸或（氨基）苯丙氨酸分别取代残基Tyr68和Tyr224，对获得的突变体分析表明，Tyr68是自由基C26•的氢供体，而Tyr224没有重要作用。
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在第68位被HAT活性酪氨酸类似物取代的FtmOx1突变体中，EPR分析发现其快速累积的自由基表现出光谱蓝移，并且在氟取代的情况下，表现出19F耦合的EPR光谱。相反，功能性Tyr224取代突变体在产生Verruculogen时产生的自由基的光吸收和EPR特征没有发生变化。
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通过质谱和同位素标记实验鉴定，Tyr68Phe突变体的主要替代产物为26-羟基-21,27-内过氧化物化合物，该化合物是通过长寿命自由基C26•捕获一当量O2后形成。该化合物也在野生型FtmOx1和68位具有较不易氧化的2,3-F2Tyr的突变体中与Verruculogen形成竞争。
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这一结果突出了该酶在避免氧反弹和第二次氧偶联以选择性获得Verruculogen方面必须应对的巨大化学挑战。
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参考文献：Use of Noncanonical Tyrosine Analogues to Probe Control of Radical Intermediates during Endoperoxide Installation by Verruculogen Synthase (FtmOx1)
ACS Catal. 2022, 12, 6968−6979
原文作者：Chi-Yun Lin,* Angel L. Muñoz Hernández, Tatiana N. Laremore, Alexey Silakov,* Carsten Krebs,* Amie K. Boal,* and J. Martin Bollinger, Jr.*
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