JACS | 无内含肽的表达蛋白连接技术

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今天给大家介绍的文章是最近发表在JACS上的Expressed Protein Ligation without Intein该工作中作者开发了一种新型表达蛋白C端的连接技术,命名为(activated cysteine-directed protein ligation, 简称为ACPL)。这一新技术的开发,极大程度地改良了传统的表达蛋白连接expressed protein ligation)。ACPL技术使用氰化试剂直接激活了重组蛋白中的半胱氨酸,进而可与小分子胺、多肽或蛋白片段进行化学连接。文章的通讯作者是德州农工大学的Wenshe Ray Liu教授。

自然化学连接的概念最早由Dawson等人在1994年提出,其为一个C端为硫酯的蛋白或者多肽与另一分子N端的半胱氨酸选择性地发生硫酯交换反应,随后发生SN的酰基转移形成较大的蛋白或多肽(图1)。鉴于具有半胱氨酸N-末端的蛋白质可以重组产生,这一概念的发展使得合成具有功能化N-末端的大蛋白质成为可能。为了扩大其合成范围,还开发了一种相关技术,称为表达蛋白连接(expressed protein ligation)。该技术使用C端带有内含肽的重组融合蛋白生成硫代酯,用于合成功能化的C端蛋白。另一个值得注意的技术是肽酰肼连接,它通过化学反应将稳定的肽酰肼转化为易离去基团,进而在C末端引入硫酯结构。

图1. 自然化学连接以及肽酰肼连接反应

虽然蛋白质连接技术已经取得了广泛的发展,但是目前仍需要进一步的改进。对于内含肽催化生成蛋白质硫酯的严格要求使得许多不溶性和难以折叠的融合蛋白不能加工。靶向蛋白的C末端残基直接与内含肽的N端相连,也会显著影响蛋白质的剪接效率,此外融合蛋白的纯化也存在着过早水解等问题。在本工作中作者报道了一种简单的C末端功能化的方法,实现了无需酶催化的高效的表达蛋白连接。
为了开发一种更通用的、基于半胱氨酸的应用于蛋白质C末端功能化的方法,作者借鉴了一个经典的工业化学过程,即氰化皮革鞣制。早在20世纪初期,人们便已经使用氰化物盐处理兽皮和羊毛,以减少蛋白质中的二硫键。在此过程中,氰化物共价与半胱氨酸蛋白结合形成硫氰酸酯,半胱氨酸的酰胺氮与其发生可逆的分子内加成反应,生成1-酰基-2-亚胺噻唑烷中间体。与普通酰胺相比,该中间体中的酰胺键明显减弱,因此可以缓慢水解或被亲核试剂进攻(图2)。早期的蛋白质化学家利用这种反应来绘制蛋白质序列,并用其他氰化试剂如2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB),将氰基直接转移到还原的半胱氨酸蛋白上,以避免形成剧毒的氰化物。
根据该反应机理,在反应形成活泼环状中间体后加入强亲核试剂(比如胺),将引发酰基上的亲核取代。所提供的小分子胺连接产物可用于进一步的蛋白质连接过程。由于此方法即活化半胱氨酸蛋白连接(ACPL)不涉及酶,且为化学连接,因此它具有高度的可控性、选择性和多样性。

图2. ACPL的基本原理

接下来作者测试了此方法的可行性。作者合成了Boc-Xxx-Cys-OMe二肽,其中Xxx的结构在脯氨酸等7种氨基酸之间变化,并与等量的NTCB反应,然后在二氯甲烷中与丙炔胺连接。结果表明所有二肽均可以不同产率形成期望产物。由于这些反应是在DCM中进行的,因此具有疏水性和大侧链的氨基酸往往具有较高的产率,而具有相对较小和亲水性侧链的氨基酸产率较低。作者使用核磁共振氢谱表明该反应并未导致半胱氨酸前的氨基酸的外消旋。
作者进一步用重组蛋白测试了ACPL的通用性。作者选择天然缺乏半胱氨酸的泛素(Ub)作为模型蛋白,在大肠杆菌中产生并纯化了具有G76C突变和C末端6×His标记(Ub-G76C-6H)的重组Ub。然后作者将12种小分子胺,包括丙炔胺(Pa)、烯丙胺(Aa)、联氨(Ha)、L-D-氨基酸,连接到Ub-G76C-6H上。(图3)作者使用ESI-MS检测了反应结果,所有的反应产物分子量均符合预期,产率在50-90%之间,几乎没有水解的副产物(图4)。

图3. 泛素与小分子胺的连接反应

作者对温度和反应时长进行了不同的尝试,发现在8-37 ℃以及4-16 h区间内,反应产率未发生较大的变化,因此最终确定8 ℃4 h的条件对于ACPL反应是足够的。
作者认为泛素本身具有空阻最小的G75残基,若换为其他氨基酸可能会影响反应效率,因此作者将其换为了其他氨基酸进行了实验。作者统一使用Ha即肼作为反应物,实验结果表明该氨基酸残基结构对连接反应几乎没有影响,然而与苏氨酸等小型氨基酸相比,色氨酸等较大氨基酸确实产率较低。
为了证明连接反应可能在更具结构限制的环境中起作用,作者在Ub球状区域的两个残基K48K63处引入了半胱氨酸突变并与Ha进行ACPL反应。ESI-MS结果表明ACPL在结构受限的蛋白区域内反应良好。

图4. 泛素与小分子胺的连接反应结果

接下来作者还使用ACPL反应合成了多种UbUbl探针,利用ACPL合成了H2AK129ac,证明了此反应广泛的应用范围。
值得一提的是作者还利用ACPL结合肽酰肼连接反应合成了活性RNAH。证明了对于具有一个以上氨基的大分子或肽的连接,可以将ACPL与肽酰肼连接结合起来以解决非特异性问题。
综上所述,作者开发了一种新的表达蛋白连接技术ACPL,该技术使用氰化试剂直接激活重组蛋白中的半胱氨酸,与小分子胺、多肽或蛋白片段连接。该方法不需要酶催化,并且是可控、多用途、简单且高效的,它可以广泛应用于合成多种具有特定功能的蛋白质。


作者:WLT       校稿人:WH

DOI: 10.1021/jacs.0c00252

Link: https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c00252


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