https://doi.org/10.1021/acscatal.0c04038糖苷键的选择性水解是重要的生理转化过程之一。目前，除天然的各类糖苷酶外，鲜有人工催化剂可以实现高选择性的糖苷键催化水解。近日，爱荷华州立大学Yan Zhao教授团队基于课题组近年发展的自组装胶束分子印迹策略，成功构筑了一类水溶性纳米粒子人工糖苷酶，首次实现了在弱酸性温和条件下对不同糖基和α/β糖苷键的高选择性催化水解，为人工合成糖苷酶的开发奠定了重要科学研究依据。碳水化合物是地球上最丰富的一类生物分子，具有多种重要的生理功能，包括能量存储，细胞结构支持，细胞信号传导和免疫。大多数生物利用其基因组的1-3％来编码合成用于碳水化合物转化和水解的酶。然而，这些酶中的绝大多数非常难以获得且稳定性差，在基础研究和实际应用中，迫切需要开发新的化学工具或人工合成催化剂来操纵碳水化合物转化与水解。要点1：通过对分子印迹模板分子的化学结构的适当调节，作者通过自组装胶束的分子印迹方法，首次实现了高效且精确地在分子水平构建仿酶活性催化位点。这类催化活性位点，一方面包括基于硼酸功能化的底物键合位点，以实现对不同4-硝基糖苷反应底物的选择性键合；另一方面，活性位点可以将酸催化剂以“plug and play”的方式通过疏水作用为驱动力精确地“安装”在需要切断的糖苷键附近，并最终实现高选择性地糖苷键催化水解。要点2：通过对分子印迹模板分子的连接糖苷键α/β构型地调节，作者展示了不同催化剂对4-硝基-β-葡萄糖糖苷键和4硝基-α-甘露糖苷键的高选择性催化水解，实现了一类通用的人工糖苷酶催化剂的制备方法。要点3：作者通过系统地将酸性 “安装”在催化位点后测试其催化活性发现，相比于“安装”酸性更强的磺酸/磷酸类催化剂，酸性较弱的羧酸催化剂却表现出更高地催化活性，与一般地水相中酸催化地糖苷键水解活性完全相反。▲图1.基于自组装胶束分子印迹策略合成人工糖苷酶催化剂及其对4-硝基-葡萄糖苷底物1β和金刚酸2a的选择性键合的示意图。
图1以模板分子3为例，展示了利用自组装纳米胶束分子印迹法制备水溶性人工糖苷酶催化剂。首先，将表面活性剂4分散在水中使其自组装形成纳米胶束，将印迹模板分子3，胶束内部交联单体5和光聚合引发剂6通过疏水作用溶解在自组装纳米胶束中。紧接着，通过连续的Cu(I)催化点击化学反应，第一步以叠氮化物7将自组装纳米胶束的表面交联，随后通过叠氮化物8将纳米粒子表面功能化线性的多糖衍生物确保其具有较好的水溶性的同时简化这类纳米粒子的纯化后处理操作。最终，通过光诱导的自由基聚合反应实现纳米粒子内部的分子印迹过程，并通过简单的酸洗与丙酮沉淀步骤完成最终催化剂MINP（3a）的制备。▲图2.（a）320 nm紫外吸收光谱下监测糖苷底物1β的水解过程。绿色曲线为仅在10 mM MES缓冲溶液pH6.0中的水解过程；蓝色曲线为MINP（3b）和金刚酸2a同时存在条件下的水解过程；红色曲线为MINP（3a）和金刚酸2a同时存在条件下的水解过程。（b）不同pH条件下MINP（3a）和金刚酸2a同时存在的水解速率。
图2a实验结果表明，MINP(3a/3b)催化剂相比于空白缓冲溶液条件，都具有明显的催化效果。其中，在都使用金刚酸2a时，MINP(3a)对底物1β的催化活性显著高于MINP(3b)催化剂。图2b实验结果表明，pH 6是催化剂MINP(3a)和金刚酸2a催化底物1β水解的最佳pH条件。此外，作者通过ITC滴定实验测定了在在pH 6的缓存溶液中催化剂MINP(3a)对金刚酸2a的结合常数高达1.22×106 M-1,对催化底物1β的结合常数则为8.59×104 M-1。以上实验结果表明，构筑的催化活性位点不仅可以对特定底物实现特异性键合，而且可以通过强疏水作用，将酸类催化剂“安装”在糖苷键附近，用以高选择性的酸催化糖苷键水解。▲图3.（a）MINP（3a）和金刚酸2a同时存在条件底物1β的水解过程的Michaelis-Menten动力学拟合曲线图。（b）催化剂MINP（3a）和金刚酸2a同时存在的水解500当量1β时反应时间随产物4-硝基苯酚浓度的变化曲线。
图3a表明，经过Michaelis-Menten动力学实验拟合分析MINP(3a)和金刚酸2a在特定条件下催化底物1β水解的最大反应速率Vmax为2.23 μM/min,米氏常数Km约为169 μM，该催化剂的催化效率约为2640 M-1min-1。图3b表明，当仅使用500当量的反应底物1β时，,MINP(3a)和金刚酸2a在600min内实现的转化数(TON)为411，表明该催化剂具有优异的催化效率。▲图4.（a）MINP（3a）和金刚酸2a存在条件下320 nm紫外吸收光谱监测不同糖苷底物1β，1α，9β和10β的水解过程。（b）MINP（3a）和金刚酸2a存在条件下不同糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β的相对准一级反应反应速率比较图。
图4表明，针对不同构型α/β-糖苷键连接的糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β，MINP(3a)和金刚酸2a可以实现对β-糖苷键连接的糖苷底物1β，9β和10β更高的水解活性。此外，针对不同糖基的糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β，MINP(3a)和金刚酸2a表现出对葡萄糖糖苷键的水解活性大于甘露糖糖苷键大于半乳糖糖苷键，即综合水解活性(选择性)表现为: 1β＞9β＞10β＞＞1α，9α/10α。▲图5.基于α-甘露糖苷键和月桂酸分子印迹模板3c的合成。
▲图6.（a）MINP（3c）和月桂酸存在条件下320 nm紫外吸收光谱监测不同糖苷底物1α，9α，9β和10α的水解过程。（b）MINP（3c）和月桂酸存在条件下不同糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β的相对准一级反应反应速率比较图。
最后如图5所示，作者合成了基于月桂酸催化的针对α-甘露糖糖苷键水解的分子印迹模板3c。图6表明，针对不同构型糖苷键连接的糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β，MINP(3c)和月桂酸可以实现对α-糖苷键连接的糖苷底物1α，9α和10α更高的水解活性。此外，针对不同糖基的糖苷底物1α/1β，9α/9β和10α/10β，MINP(3c)和月桂酸表现出对甘露糖糖苷键的水解活性大于葡萄糖糖苷键大于半乳糖糖苷键，即综合水解活性(选择性)表现为: 9α＞1α＞9β＞1β＞＞10α/10β。在此项研究工作中，我们基于自组装胶束分子印迹法成功建立了一类人工糖苷酶的合成方法，并且首次实现了高效且精确地在分子水平构建仿酶活性催化位点。这类催化活性位点，一方面通过基于硼酸功能化的底物键合位点，以实现对不同4-硝基糖苷反应底物的选择性键合；另一方面，活性位点可以将酸催化剂以“”“plug and play”的方式通过疏水作用为驱动力精确地“安装”在需要切断的糖苷键附近，并最终实现高选择性地糖苷键催化水解。这项研究工作的发表将为人工糖苷酶的设计和发展奠定重要的参考价值。
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