浅谈柱层析的几个技巧

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柱层析就是通常所说的过柱子,又叫柱色谱,属于色谱法中使 用最广泛的一种方法。对于含有多种有机物的混合样品,用重结晶无法提纯时,柱层析法可以说是有机实验中最有效的分离手段。实验室中常用的是以硅胶和氧化铝做固定相的吸附柱。硅胶层析 法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离,一 般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被 硅胶吸附,整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。



虽然很多化学实验书中都叙述了柱层析的实验方法,但大多 数都是比较雷同地泛泛地描述,而且有些描述在实验室中并不适用。例如,很多书中都提到装柱时先在底层铺一层石英砂,倒入固 定相后再在顶部铺一层石英砂。比较繁琐,而且效果也不是很好, 在实验室中不适用。根据多年来使用柱层析的操作经验,本文总 结了在使用柱层析时的几个技巧:


1、硅胶的使用

初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了,有时还会有大量 的硅胶剩余,浪费硅胶,这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有 掌握。柱层析用的硅胶一般是100-200目,100毫升硅胶的质量在 47克左右,如果装一个直径是2.8厘米的柱子,可以装18厘米高。为了避免浪费硅胶和溶剂,最初学习装柱时最好对实验室中各种 不同规格的柱子摸摸底。方法很简单:用量简量出100毫升干硅 胶,直接倒入各种规格的柱子中,敲实,用刻度尺鼍出硅胶在柱子 中的高度,这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候町以 根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量,这样就可以大大 地节省硅胶的使用,避免造成没有必要的浪费。欢迎关注化学科讯。称量硅胶时一般 称30-70倍于上样量,如果极难分,也可以用100倍量以上的硅胶。




2、洗脱剂的使用

洗脱剂的极性可用薄层层析来确定,一般以待分离样品Rf值 为0.2-0.3为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质Rf值之差最大 化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好,如果Rf在0.6, 即使相差0.2也不容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的 过程,可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度,肯定不如 (0.2/0.3)的三次方或四次方大。欢迎关注化学科讯。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好,但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多,所以分离效果好。解决的办法就是降低洗脱剂的极性,一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用 的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时,可用采梯度洗脱的方法,即逐渐增加溶剂 的极性,使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。



常用的展 开剂极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统;极性较大的用甲醇:氯仿 系统;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统;拖尾可以加入少量 氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物,一是增加柱子的长度和 直径,二是减小洗脱剂的极性,这样可以很好地将混合物分开。在 同样能洗脱的情况下,尽量使用毒性小的洗脱剂。例如,乙酸乙酯:石油醚系统和二氯甲烷:石油醚系统,在同样都能洗脱的情况下, 应该用毒性小的乙酸乙酯:石油醚系统。 


另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的 是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,混合溶剂的比例由于挥发 度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时 比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分,使用前先要用 干燥剂干燥好才能使用。


3、装柱子的技巧

柱层析的装柱非常重要,装柱的效果会直接影响层析分离效 果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单,使用 也最普遍,就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆, 柱子底部先用脱脂棉塞紧,然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。欢迎关注化学科讯。用漏斗将活好的固定相倒入柱子中,打开底部活塞,将柱子中高出 固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打,将固定相敲实,做到 密实均匀无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好 柱子,而且在柱子中没有气泡产生。干法装柱与湿法装柱刚好相 反的是,它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱 子中,然后用油泵抽柱子底部,相当于减压过柱,直到柱子变得很 结实,再用淋洗剂“走柱子”。干法装柱的一个缺点就是在装入洗 脱剂后,由于溶剂和固定相之间的吸附放热,所以柱子容易变花, 影响分离效果。


解决的方法是:(1)固定相一定要添加结实;(2)一 定要用较多的溶剂“走柱子”。直到柱子的下端不再发烫,恢复到室 温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱,最后都要求所装的柱 子结实、匀称、无气泡。


4、上样的技巧


上样也有湿法和干法之分:湿法一般用淋洗剂溶解样品,也可 以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移 得到的溶液,沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在不用海沙的情 况下,尽量不要破坏硅胶面。加样后,打开柱底活塞,让固定相充 分地吸附所加样品。欢迎关注化学科讯。然后再加入一些洗脱剂,再充分地吸附后将 一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就町以放心地加入大量洗脱 剂,而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没 关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量 的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是 比较好的固体才会析出,这就需要先重结晶样品,得到大部分的产 品后剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系,直接过柱就 行,样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解,最后随着洗脱剂流出。



有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能一卜柱(比如DMF, DMSO等,会随着溶剂一起走,显色是一个很长的脱尾),这时就必 须用干法上柱了。干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后, 在加入少量硅胶,欢迎关注化学科讯。拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按l:l的 量混合,硅胶使用的量也可以少一些,但是要保证在旋干后,不能 看到明显的固体颗粒,让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心 地加入到装好的柱子中,加入洗脱剂洗脱。


5、过柱的技巧


柱层析按过柱时的压力可以分为:加压,常压,减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是 会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候常压柱是效率最高的,但是时间也最长,例如一些 天然化合物的分离,有时一个柱子过几个月也有可能。减压柱能 够减少硅胶的使用量,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥 发,有时会在柱子外面有水汽凝结,另外有些比较易分解的东西可 能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气,噪音大,时间长,所以减 压过柱用得比较少。



加压过柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,但用外加压力 可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是乐缩空气,双连球或 者小气泵(用鱼缸供气的加压泵就行)。特别是在容易分解的样品 的分离中很适用。一般压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减 低分离效果。欢迎关注化学科讯。因为加压过柱效率高,分离效果较好,所以加压过柱 在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。一蝗低沸点溶剂装 柱时往往会在柱子中产生气泡,使柱子变花,利用加压过柱法在装 柱时就可以有效地解决这个问题,而且可以使柱子很快装实。随着科技的发展,色谱法的技术也日新月异,但柱层析实验技 术还是比较简单和实用的,每个科研工作者在使用柱层析时,可以 根据自己的实际情况来不断地摸索,不断地总结和提高柱层析的 实验技术。

来源:冷丰收 - 《华章》 - 2010年32期



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