近日，武汉大学张帆团队联合中国科学院天津工业生物技术研究所苏浩团队，在国际权威期刊《Angewandte Chemie International Edition》发表题为“Cytochrome P450 Mediated Cyclohexane Ring Formation in Forazoline Biosynthesis”的研究论文，首次揭示了抗真菌海洋天然产物forazoline A中环己烷结构的生物合成机制。该研究拓展了P450酶的催化多样性认知，并为高活性抗真菌衍生物的理性设计奠定理论基础。

随着多重耐药真菌感染的全球蔓延，开发具有新型作用机制的抗真菌药物已成为迫切需求。Forazoline A是由海洋放线菌Actinomadura sp. WMMB-499产生的的聚酮/非核糖体肽（PK/NRP）杂合大环内酯类天然产物，其通过独特作用机制展现显著体内抗真菌活性。然而，forazoline A复杂的生物合成路径及关键后修饰酶功能长期未被阐明，特别是关键药效基团环己烷的形成机制仍属未解之谜。

本研究通过基因组测序与生物信息学分析，定位含28个基因的forazoline生物合成基因簇（fraz）。采用细菌人工染色体（BAC）技术，将完整的fraz基因簇导入Streptomyces albus J1074进行异源表达。通过逐一敲除frazP1、frazP2和frazP3基因，发现frazP2的缺失导致产物中环己烷结构缺失，表明FrazP2在环化中发挥关键作用。

进一步体外酶促反应显示，FrazP2可将底物2转化为含有环己烷结构的产物8。同位素标记实验表明8中两个羟基（OH-17和OH-20）分别来源于分子氧（¹⁸O₂）和水（H₂¹⁸O），揭示氧原子来源具有双重性。动力学分析表明FrazP2对底物2和7均遵循经典Michaelis–Menten动力学，且催化效率相近。

为阐明FrazP2催化的分子机制，研究者解析了FrazP2在apo状态和结合底物2状态下的晶体结构，分辨率分别为1.8 Å和2.3 Å。结果显示底物C16=C17双键垂直于血红素面，且C-17与血红素氧化中心距离最短，支持其为初始攻击位点。突变实验证实多个关键氨基酸残基参与底物定位及催化活性，而经典保守酸-醇对突变几乎不影响活性，提示该酶具有不同于传统P450酶的催化机制。研究结合分子动力学模拟与量子化学计算，提出FrazP2通过"氧化-质子转移-环化"多步催化环己烷形成，并合理解释了两个羟基来源的同位素实验结果，表明其催化机制具有非典型性，突破了对P450酶功能的传统理解。

此外，通过异源表达体系获得系列forazoline开环人工产物展示出4–8倍于天然产物的抗真菌活性，显示了结构柔性在药物膜渗透性中的关键作用，为新型抗真菌药物设计提供重要思路。

Cytochrome P450 Mediated Cyclohexane Ring Formation in Forazoline Biosynthesis

Xinru Chen, Yujie Zhang, Shiqi Li, Weiting Liao, Dr. Weixin Tao, Prof. Zixin Deng, Prof. Tim S Bugni, Prof. Hao Su, Prof. Fan Zhang

武汉大学博士生陈心茹和中国科学院天津工业生物技术研究所博士生张玉婕为论文共同第一作者。张帆教授和苏浩副研究员为共同通讯作者。研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划青年科学家项目、武汉大学启动经费和武汉大学泰康生命医学中心经费的资助。

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202504925