DNA双链损伤断裂会在细胞中诱导产生一系列泛素化修饰信号，在特定部位招募DNA损伤修复因子，从而完成DNA损伤修复过程。在DNA双链断裂的早期阶段，连接组蛋白H1上的K63链型多聚泛素化介导E3酶RNF168的起始招募，实现核小体位点特异性的H2AK13/15泛素化修饰，进一步招募下游信号蛋白（如参与非同源末端连接修复通路的53BP1和同源重组通路的BRCA1/BARD1）。虽然近期对RNF168不同结构域（RING, UDM1, UDM2）的功能有了更深入的了解，但RNF168在化学特征确定（chemically defined）的多聚泛素化H1调控下的定量生化与结构机制仍然尚不明确。这一问题的解决主要受到均质、精准泛素化修饰H1样品获取的限制。

近期，清华大学化学系刘磊教授、上海交通大学药学院艾华松副教授、中国科学技术大学生命科学与医学部储国超副研究员合作发展了一种半胱氨酸-氨乙基化反应耦合酶促蛋白连接的蛋白质半合成策略（CAEPL, Cysteine-Aminoethylation coupled with Enzymatic Protein Ligation），实现了不同链长泛素修饰连接组蛋白H1的高效便捷合成，并将该策略获取的样品应用于探索组蛋白H1上K63多聚泛素化修饰调控RNF168催化H2A泛素化活性的机制研究，丰富了我们对连接组蛋白与核心组蛋白之间的修饰串扰调控图谱的认知。

该策略首先将连接组蛋白H1.0上特定位点赖氨酸突变为半胱氨酸，经半胱氨酸-氨乙基化反应、巯基保护基（Acm）脱除，获得侧链装载有可用于自然化学连接的巯乙胺基团的H1.0，随后通过E1泛素激活酶UBA1介导的自然化学连接反应将单泛素及酶法制备的K63泛素链装载至H1.0上，从而成功获得特定位点携带不同链长泛素修饰的连接组蛋白H1.0，产物经过HPLC、ESI-MS、SDS-PAGE等分析手段得到表征确认（图1，2）。

接着，作者将上述CAEPL策略制备的不同链长泛素化修饰的H1.0组装成相应染色质小体，通过体外生化重构定量分析了不同RNF168截短体在各种染色质小体底物水平催化H2A泛素化修饰的活性差异。研究表明，只有当H1.0上存在K63泛素链修饰时才能促进RNF168对H2A的泛素化活性，同时这种激活效果主要由RNF168的UDM1结构域贡献。此外，动力学分析确证H1.0上泛素链长度的增加，提高了NF168和染色质小体的结合力（图3）。

作者进一步借助化学共价交联构建了RNF168在H1.0–K63-Ub₃染色质小体上催化泛素转移过程的中间体模拟物，并结合单颗粒冷冻电镜技术解析了该复合物的三维结构。分析结果显示，DNA进出口处存在H1.0及相应的泛素密度，其延伸方向与空间距离符合泛素化反应需求（图4）。

进一步，为探索连接组蛋白H1.0的K63多聚泛素化修饰在更高阶染色质环境下对RNF168的活性影响，作者组装了仅在一侧含有H1.0–K63-Ub₃的不对称双核小体。对双核小体底物水平生化实验的定量分析表明，RNF168及其截短体在该底物上表现出对H1.0–K63-Ub₃同侧和异侧H2A相当的泛素化活性（图5）。

该工作设计开发了一种可用于在连接组蛋白特定位点装载特定链型泛素化修饰的高效合成策略，并结合生化和生物物理手段揭示了K63多聚泛素链修饰的连接组蛋白通过增强RNF168与底物的结合力来促进其对H2A的泛素化活性。该工作增进了对连接组蛋白和核心组蛋白之间翻译后修饰串扰调控网络的多维认知，扩充了翻译后修饰蛋白研究的化学工具箱。