Nat. Biotechnol. | 通过 DNA 聚合酶和 HUH 内切酶实现基因组编辑

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分享一篇最近发表在Nature Biotechnology上的文章,本文的题目是“Click editing enables programmable genome writing using DNA polymerases and HUH endonucleases”。本文的通讯作者是来自美国麻省总医院和哈佛医学院的 Benjamin P. Kleinstiver。本文的核心是作者们开发了一种新的精确编辑基因组的技术,因为该策略中所用到的HUH内切酶能够“自发且共价地”连接到其单链 DNA 底物上,因此作者们将其命名为 Click editing。


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如果想要对基因组进行编辑,比如借助 Cas9 蛋白切割基因组产生双链断裂 DSB,细胞会采取同源修复 HDR 机制进行修复。但是,这种修复机制是依赖细胞周期的。因此,不依赖于细胞周期的编辑技术应运而生,比如碱基编辑器 BE 和先导编辑 PE。但是,BE 的脱靶效应很高,PE 的编辑效率很低,而且先导 gRNA 的设计也比较复杂。
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作者们就想到,不依赖细胞周期,也可以将 DNA 聚合酶与 Cas9 nickase(只在 DNA 的一条链上产生缺口,并不会引起双链断裂)“缝”起来。为了能够让单链 donor DNA 快速地聚集在编辑器附近,作者又想到可以继续给 Cas9 nickase 上“缝”一个单链 DNA 结合域。HUH 内切酶能够特异地识别其单链 DNA 底物,并通过蛋白上的酪氨酸,在二价金属离子 Mg 或 Mn 存在的情况下,进攻其底物特定碱基的磷酸,形成蛋白-单链 DNA 复合物,这一过程类似于 Click chemistry,因此,作者将该策略也命名为“click editing”。


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所以,点击编辑器 Click editor 包括四部分,分别是 Cas9 nickase、DNA 依赖的 DNA 聚合酶、单链 DNA 结合域和引导蛋白到编辑区域的 sgRNA。单链 donor DNA 也由三部分组成,分别是与点击编辑器的单链 DNA 结合域发生 Click 的序列、聚合酶延伸模板 PT(可以在该区域引入突变)和引导单链与基因组结合的片段 PBS。



作者们对点击编辑器中的 DNA 聚合酶和单链 DNA 结合域,donor DNA 中 PT 和 PBS 的长度,进行了筛选和摸索,以获得更优的编辑效率。作者们也与先导编辑进行了比较,目前的版本效果明显地优于 PE1 编辑器,但是要略逊于 PE3 编辑器。


本文作者:Zihua Liu
责任编辑:WYQ
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41587-024-02324-x
文章引用:10.1038/s41587-024-02324-x




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